贝伐单抗动脉介入超选化疗对大鼠脑胶质瘤的影响

高 飞，王英滨

（1．中国医科大学附属第四医院，辽宁沈阳110032；2． 沈阳医学院附属中心医院，辽宁沈阳 110024）

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，在所有颅内肿瘤中约占44.69%。胶质瘤由于浸润性生长方式及侵袭性强的特性，目前单纯用任何一种方法均不能彻底根治，极易复发，预后较差[1]。由于脑胶质瘤患者生存期和生存质量较差，因此给患者及其家庭造成沉重的负担。近年来，医护工作者逐渐重视胶质瘤的综合治疗，包括化疗、放疗、生物治疗及其他治疗等。

化疗是胶质瘤治疗中重要的一环，由于人体大脑具有血脑/瘤屏障，药物很难通过；胶质瘤中药物有效浓度较低，肿瘤对药物的敏感性不够以及药物对全身的毒副作用等因素影响了临床疗效。研究[2]发现，动脉内注射化疗药物可以增加胶质瘤内部的药物含量。目前超选择性动脉化疗药物较多，其中顺铂(cisplatin，CDDP)是无机重金属化合物，为细胞周期非特异性药物，主要干涉DNA与RNA相关蛋白质的合成。贝伐单抗(bevacizumab，BVZ)是一种重组的人类单克隆IgG1抗体，通过抑制人类血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生物学活性而起作用。目前研究显示BVZ与其他化疗药物联用可很大程度上改善脑胶质瘤的治疗[3]。但是，BVZ是否能够单药治疗复发性恶性胶质瘤方面的研究尚无报道。因此，本研究对C6胶质瘤大鼠模型进行动脉介入超选化疗，分别应用CDDP和BVZ作为化疗药物，探讨动脉介入超选化疗应用BVZ对胶质瘤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

C6胶质瘤细胞[美国菌种保藏中心(ATCC)]；Wistar大鼠，体质量180～200 g(中国医科大学实验动物中心)；贝伐单抗(瑞士Roche公司)。RPMI-1640培养基(美国Sigma公司)；VEGF、P21蛋白(P21)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、金属基质蛋白-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2) 抗体均购于美国Santa Cruz Biotechnology公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG二抗均购于北京中杉金桥生物技术有限公司；VEGF、P21、Bcl-2 和MMP-2引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Real time-PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司。

1.2 仪器与设备

脑立体定向仪(美国Stoelting公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)，-80 ℃超低温冰箱(日本SANYO公司)，台式低温超速离心机(德国Sigma公司)，超净工作台(苏州净化设备集团)，CO2恒温培养箱(美国Thermo Scientific公司)，聚丙烯酰胺凝胶电泳装置(美国Bio-Rad公司)，转印仪(北京市六一仪器厂)，Las3000成像系统(日本FUJIFILM公司)，凝胶成像分析软件(江苏捷达科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 C6细胞培养 C6胶质瘤细胞复苏成功后，重悬于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，次日更换培养液，继续培养，观察细胞生长状况。

1.3.2 建立脑胶质瘤动物模型 60只SPF级SD大鼠(合格证号211002300016826)，由中国医科大学实验动物中心提供，雄性，体质量180～200 g。大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射进行麻醉，头部固定在脑立体定位仪上。常规消毒后，沿中线纵向切开头皮约1 cm，暴露颅骨。根据大鼠头部立体定向解剖图谱确定对应于右脑尾状核的钻孔位置：冠状缝与矢状中线交点处前1 mm，矢状缝右3 mm。微量进样器抽取C6细胞悬液10 µL(含1×105个细胞)，注射速度为1 µL/min，缓慢拔针。骨孔用牙托粉迅速封闭。缝合切口后，肌注青霉素0.1 mL，继续饲养。

1.3.3 实验动物分组及治疗 C6胶质瘤细胞种植后第7天开始，将建模成功的55只大鼠随机分为5组，每组11只：对照组(经尾静脉注射等量生理盐水)、静脉注射顺铂组(V+CDDP，经尾静脉注射5 mg/kg CDDP[4])、静脉注射贝伐单抗(V+BVZ，经尾静脉注射5 mg/kg BVZ[5])、动脉注射顺铂组(A+CDDP，经颈动脉注入5 mg/kg CDDP)和动脉注射贝伐单抗组(A+BVZ，经颈动脉注入5 mg/kg BVZ)。隔天注射1次，持续7 d。

1.3.4 各组大鼠肿瘤体积的测量 给药治疗7 d后，称体质量，10%水合氯醛将大鼠麻醉，生理盐水灌流，后经4%的多聚甲醛灌流。断头取脑胶质瘤组织，放入30%蔗糖中脱水2 d，4%多聚甲醛固定24 h，液氮速冻后在-25 ℃的恒冷冰冻切片机上切片，厚度为8 µm，行HE染色。应用MCID图像分析软件测量计算脑胶质瘤的病灶区面积，按下式计算脑肿瘤的体积：

脑肿瘤的体积=面积总和×组织间隔厚度

1.3.5 Real time-PCR检测mRNA表达 给药治疗7 d后，取50 mg大鼠脑胶质瘤组织，提取RNA，检测浓度及D(260)/D(280)。按试剂盒说明书反转录为cDNA，引物如下：VEGF，上游引物5'-GGTGAGAGGTCTAGTTC CCGA-3'，下游引物5'-CCATGAACTTTCTGCTCTTC-3'；p21，上游引物5'-AGTAGACACGAAACAGGC-3'，下 游 引 物5'-TTCCCATCTTTGCTCATC-3'； Bcl-2， 上游引物5'-CGGGAGAACAGGGTATGA-3'，下游引物5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGAT-3'； MMP-2： 上 游 引 物5'-GGAAGCATCAAATCGGACTG-3'，下游引物5'-GG GCGGGAGAAAGTAGCA-3'。反应条件：94 ℃、3 min，94 ℃、30 s，60 ℃、1 min，72 ℃、1 min(30个循环)，72 ℃、2 min。mRNA相对表达差异采用2-ΔΔCT法计算，进行比较。

1.3.6 Western blot检测蛋白表达 给药治疗7 d后，取50 mg大鼠脑胶质瘤组织，提取蛋白。脑组织在预冷的组织裂解液中剪碎，匀浆约1 min，冰浴30 min，17 000 r/min、4 ℃离心1 h，收集上清。加入样品缓冲液，然后将样品置于沸水浴中加热5 min使蛋白质变性。8% SDS-PAGE电泳后进行转印，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，第2天加入稀释的一抗(1∶200)，室温2 h，漂洗3次后，加入稀释的相应二抗(1∶5 000)，室温2 h。漂洗3次，发光显色，Quantity One软件对各组蛋白条带光密度进行分析。

1.4 统计学分析

实验数据采用SPSS for Windows18.0软件进行统计-学分析。数据以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 不同治疗方法对大鼠肿瘤体积的影响

对照组大鼠脑胶质瘤体积为(9.02±0.74) mm3，V+CDDP组的肿瘤体积为(7.67±0.70) mm3、V+BVZ组为(6.57±0.69) mm3、A+CDDP组为(5.58±0.37) mm3、A+BVZ组为(4.81±0.20) mm3，均较对照组明显减小，差异均有统计学意义(P＜0.01)；且A+CDDP组肿瘤体积较V+CDDP组相明显缩小(P＜0.01)，A+BVZ组肿瘤体积较V+BVZ组明显较小(P＜0.01)，结果显示，动脉注射具有较强的抑制胶质瘤体积的作用。同时，V+BVZ组肿瘤体积显著小于V+CDDP组，差异具有统计学意义(P＜0.01)，A+BVZ组肿瘤体积显著小于A+CDDP组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，提示BVZ对胶质瘤的抑制作用较CDDP更强，见图1。

图1 不同治疗方法对大鼠脑胶质瘤体积的影响(n=11)

2.2 不同治疗方法对大鼠脑胶质瘤VEGF、P21、Bcl-2和MMP-2 mRNA表达水平的影响

利用Real time-PCR方法测定各组大鼠脑胶质瘤组织中相关基因的表达(见图2)。结果显示，V+CDDP组、V+BVZ组、A+CDDP组和A+BVZ组的VEGF、Bcl-2及MMP-2的mRNA表达与对照组相比均明显降低，差异均有统计学意义(P均＜0.05)；同时，P21的mRNA表达明显增多，差异亦均有统计学意义(P均＜0.05)。与V+CDDP组相比，A+CDDP组的VEGF、Bcl-2及MMP-2的mRNA表达均显著降低(P＜0.05)，A+BVZ组上述各mRNA表达也显著低于V+BVZ组(P＜0.05)。另外，A+CDDP组P21的mRNA表达较V+CDDP组显著升高(P＜0.01)， A+BVZ组 P21的 mRNA表 达 也 显 著 高 于V+BVZ组(P＜ 0.01)，结果显示，动脉注射降低VEGF、Bcl-2以及MMP-2的作用以及提高P21蛋白的作用更显著。此外，V+BVZ组VEGF、Bcl-2和MMP-2的mRNA表达显著低于V+CDDP组(P＜0.05)，A+BVZ组上述各mRNA表达也显著低于A+CDDP组(P＜0.05)。而V+BVZ组P21的mRNA表达较V+CDDP组显著升高(P＜0.05)。

图2 不同治疗方法对大鼠脑胶质瘤VEGF、P21、Bcl-2和MMP-2 mRNA表达的影响(n=5)

2.3 不同治疗方法对大鼠脑胶质瘤VEGF、P21、Bcl-2和MMP-2蛋白表达的影响

Western blot检测的各组大鼠脑胶质瘤组织中相关蛋白的表达情况见图3。统计分析结果显示，V+CDDP组、V+BVZ组、A+CDDP组和A+BVZ组的VEGF、Bcl-2、MMP-2表达与对照组相比均明显降低，差异均有统计学意义(P均＜0.05)；同时，P21蛋白表达明显增多，差异亦有统计学意义(P＜0.05)。A+CDDP组VEGF、Bcl-2和MMP-2蛋白表达与V+CDDP组相比均显著降低(P均＜0.05)，A+BVZ组上述蛋白表达也均显著低于V+BVZ组(P均＜0.05)。A+CDDP组P21表达较V+CDDP组显著升高(P＜0.05)，A+BVZ组P21表达也显著高于V+BVZ组(P＜0.01)，结果显示，动脉注射降低VEGF、Bcl-2及MMP-2的表达与升高P21蛋白表达的作用较静脉注射更显著。此外，V+BVZ组VEGF、Bcl-2和MMP-2蛋白的表达显著低于V+CDDP组(P＜0.05)，A+BVZ组上述蛋白表达也显著低于A+CDDP组(P＜0.05)。V+BVZ组P21蛋白表达较V+CDDP组显著升高(P＜0.05)，A+BVZ组P21蛋白表达也显著高于A+CDDP组(P＜0.05)。结果显示，BVZ降低VEGF、Bcl-2和MMP-2蛋白的表达与升高P21蛋白的作用较CDDP更显著。

图3 不同治疗方法对大鼠脑胶质瘤VEGF、P21、Bcl-2及MMP-2蛋白表达的影响(n=5)

3 讨论

胶质瘤传统的静脉化疗因血脑屏障和血瘤屏障的制约，疗效明显受限。随着神经介入技术的飞速发展，经动脉超选化疗，由于其可能克服经静脉化疗的局限正受到越来越多的关注[6]。 Tomokatsu等[7]发现经动脉灌注可以使嘧啶亚硝脲(nimustine，ACNU)更易进入肿瘤及瘤周组织，而灌注前10 min输入20%甘露醇可使肿瘤及瘤周组织中的ACNU浓度达到最高。Levin 等[8]研究表明，灌注侧的药物浓度比同剂量静脉用药高4倍。在灌注时用定量输液泵快速输入化疗药物，可避免药物在血流中形成层流，促进药物在远端各血管分支内均匀分布，达到最大疗效。刘沣等[9]发现单次经颈内动脉灌注ACNU较单次经静脉灌注能更有效地抑制脑胶质瘤的生长。还有研究结果发现[10]，经动脉灌注途径对大鼠脑胶质瘤进行化疗，增加化疗药物的疗效，能更有效控制肿瘤的生长。本实验结果显示，动脉注射CDDP和BVZ后，大鼠脑胶质瘤体积较对照组明显缩小，并且与静脉注射相比均具有较强的抑制胶质瘤生长的作用。胶质细胞瘤一般有一条或两条主要动脉供血，研究认为肿瘤组织动脉的血流率低，动脉灌注化疗药物可以直接将药物送到肿瘤位置，减少体内循环，提高肿瘤内药物的作用浓度[11-12]，药物的半衰期短，而对周围脑组织及全身各系统的毒副作用减少，故动脉超选化疗是治疗脑胶质瘤的最佳途径。

脑胶质瘤通常存在异常过度的血管生成，而促血管形成因子血管内皮生长因子A(VEGFA)的高表达与此过程密切相关[13]。BVZ是人工合成的VEGF单克隆抗体，以VEGF为靶点竞争性结合VEGF受体，从而抑制内皮细胞的有丝分裂和血管生成，达到阻断肿瘤的血液供应的效果，最后抑制肿瘤在体内扩散。有报道显示，BVZ可作为单一用药及联合其他化疗药物用来治疗如转移性结肠癌、肺癌等其他实体性恶性肿瘤[14]。Hacibekiroglu等[15]使用BVZ单药治疗复发性胶质瘤患者，结果发现20%达到部分缓解，38%病情稳定。日本一项研究结果显示[16]使用BVZ单药治疗复发性高级别胶质瘤 患者，疾病缓解率为27.6%。本研究结果将BVZ应用治疗脑胶质瘤大鼠，也发现BVZ对胶质瘤具有较强的抑制作用。

另外VEGF与胶质瘤异常过度的血管生成有关[17]，P21是细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂家族中的重要成员，它通过抑制周期素依赖激酶复合物活性，将肿瘤抑制作用与细胞周期控制过程紧密相连[18]。Bcl-2在细胞凋亡过程中起到抑制细胞凋亡的作用[19-20]。基质金属蛋白酶2(MMP-2)，几乎能降解细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键作用[21]。本实验结果发现动脉注射降低VEGF、Bcl-2、MMP-2蛋白表达及升高P21蛋白表达的作用较静脉注射更显著。同时，BVZ较CDDP的作用更显著。

综上所述，应用BVZ动脉超选化疗，能有效控制脑胶质瘤的生长，并且对脑胶质瘤异常的血管生成、细胞周期、细胞凋亡以及侵袭迁移等过程都可能产生影响，从而达到较好的治疗效果。目前胶质瘤的治疗仍是世界公认的难题，为了延长胶质瘤患者的生存期以及生活质量，医务工作者在不断的探索新疗法。动脉超选化疗能有效控制脑胶质瘤的大小，对其深入探讨和完善将可为临床应用提供一个有效的治疗手段。

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