3种粒径纳米氧化锌与常规氧化锌对大鼠的亚慢性毒性

洪丽玲，张天宝*

（1．上海化工研究院有限公司检测中心，上海200062；2．中国人民解放军海军军医大学热带医学与公共卫生学系卫生毒理学教研室，上海200433）

纳米材料的生物学反应与其表面效应、体积效应和量子尺寸效应有关。现有资料表明，金属氧化物等纳米材料能诱导氧化应激和自由基的生成，造成多种毒性损伤，且纳米粒径越小毒性越大[1-2]。目前，纳米氧化锌(ZnO)已应用于工业和化妆品产品，在橡胶制品、油漆涂料、化纤纺织、医学诊断和治疗等领域具有广泛的应用前景，因此其安全性越来越受到关注。国内外已经对纳米ZnO的毒性开展了很多研究。有报道指出，纳米ZnO可能表现出细胞毒性、遗传毒性、氧化应激、线粒体功能障碍和凋亡、神经毒性以及炎症反应[4-6]；另有一些体内的短期毒性研究指出纳米ZnO的靶器官可能是肝脏、脾脏、肺、肾脏和心脏[7-9]。但目前尚缺乏对纳米ZnO和常规ZnO慢性或亚慢性毒性和毒作用的比较资料。因此，本研究以3种粒径纳米ZnO和常规ZnO为对象，通过腹腔注射方式观察其对SD大鼠的亚慢性毒性，比较两者的毒作用特征，拟为纳米ZnO及其他纳米物质的安全性评价积累资料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

纳米ZnO(粒径30、50和100 nm)，白色粉末，平均粒径约10 nm，比表面积＞10～60 m2/g，表面电阻1×105～1×1010Ω，水悬浮液pH值6.0～8.0，纯度≥99.9%，购自杭州万景新材料有限公司；常规ZnO(颗粒直径≤1 μm，购自Sigma)。天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)测定试剂盒购自日本WAKO公司；尿素氮(urea n itrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CRE)试剂盒购自德国Roche公司。ADVIA2120 血液细胞分析仪(拜耳，德国)、7080全自动生化分析仪(HITACHI，日本)、BX43 光学系统显微镜(Olympus，日本)。

1.2 动物分组及染毒

SPF级SD大鼠40只购自上海必凯实验动物有限责任公司[合格证号SCXK(沪)2013-0016]，体质量120～140 g，雌雄各半，按体质量随机分为分5组，分别为3种粒径的纳米ZnO(30、50、100 nm)和常规ZnO(≤1 μm)染毒组及阴性对照组(注射等体积生理盐水)，每组8只，雌雄各半。大鼠在SPF级实验动物室饲养，自由进食和饮水。温度为17～26 ℃，相对湿度为40%～70%，明暗周期为12 h/12 h。动物检疫1周后开始试验。

将纳米ZnO和常规ZnO分别用生理盐水制成混悬液，使用前超声30 min，并用漩涡搅拌器不断搅拌，无菌操作下，以10 mg/kg连续腹腔注射42 d[10]，给药体积按10 μL/g。

1.3 观察指标

1.3.1 一般状况及体质量观察 试验期间对动物的一般状况进行观察并记录体质量变化情况。

1.3.2 血象及血清生化学指标检测 停药后第2天进行腹主动脉取血，取2 mL全血EDTA-K2抗凝后进行红细胞数目(red blood cell，RBC)、血红蛋白(hemoglobin， HGB)、 白 细 胞 数 目 (white blood cell count，WBC)、中性粒细胞比例(neutrophil ratio，NEUT)、血小板数目(blood platelet，PLT)、淋巴细胞比例(lymphocyte ratio， LYMPH)和 单 核 细 胞 计 数 (monocyte count，MONO)血象检查。另取5 mL全血待自然凝固后取血清进行ALT、AST、BUN、CRE等生化指标检测，分析肝肾功能的变化。

1.3.3 脏器系数计算 解剖动物，取肝、肾、脾、肺、睾丸脏器，生理盐水冲洗血污，滤纸轻轻拭干，称取质量，按下式计算脏器系数。

脏器系数=脏器湿质量/体质量×100

1.3.4 组织病理学检查 10%福尔马林固定主要器官(肝脏、肾脏、脾脏、肺脏及睾丸)，常规石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜下观察。

1.3.5 精子涂片制作 剖开腹腔，暴露睾丸，分离两侧附睾，用眼科剪剖开附睾组织，与适量生理盐水混匀、涂片、固定、染色和观察。

精子畸形率(%)=畸形精子数/受检精子总数×100%

1.3.6 细胞凋亡的检测 用TUNEL法进行大鼠睾丸组织细胞凋亡的原位检测，二氨基联苯胺(3，3´-diaminobenzidine，DAB)显色后，光学显微镜下观察。每例切片计数5个400倍视野，以平均每100个细胞中含凋亡细胞的个数作为凋亡指数(apoptosis index，AI)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般状况及体质量变化

试验期间，各组动物的一般活动表现、摄食、饮水、分泌物和粪便性状正常，外观均无明显异常，无动物死亡。体质量是反应中毒后综合性变化的指标。由表1可见，各染毒组与对照组相比，大鼠体质量增长的差异均无统计学意义(P均＞0.05)。

表1 不同种类ZnO染毒不同时间大鼠体质量的变化(-x±s，n=8)

2.2 脏器系数

由表2可见，与对照组比较，30 nm ZnO组的肝、脾、肾的脏器系数升高；50 nm ZnO组脾的脏器系数升高；100 nm ZnO组肝的脏器系数升高；常规ZnO组肺、肾的脏器系数升高，差异均具有统计学意义(P均＜0.05)。与常规ZnO组比较，30和50 nm ZnO组脾的脏器系数均升高；30、50和100 nm ZnO组肺的脏器系数均下降，差异均有统计学意义(P均＜0.05)。

表2 不同种类ZnO染毒大鼠脏器系数的变化(，n=8)

表2 不同种类ZnO染毒大鼠脏器系数的变化(，n=8)

与对照组相比，*P＜0.05；与常规ZnO组相比，#P＜0.05.

组别 肝 脾 肺 肾 睾丸纳米ZnO 30 nm 10.01±2.06* ，#1.06±0.20* #1.70±0.17 2.44±0.40* 3.02±0.21 50 nm 9.54±1.96 ，#0.95±0.18* #1.64±0.19 2.34±0.52 3.02±0.09 100 nm 10.77±2.32* 0.90±0.22 #1.83±0.21 2.49±0.52 2.96±0.33常规ZnO 9.61±2.26 0.78±0.12 1.96±0.22* 2.39±0.55* 3.34±1.23对照组 9.06±1.55 0.77±0.11 1.76±0.28 2.28±0.45 3.02±0.09

2.3 血象指标

由表3可见，与对照组相比，3种粒径纳米ZnO组和常规ZnO组的RBC、NEUT比例和PLT均明显升高(P＜0.05)，而LYMPH下降(P＜0.05)；30、50 nm ZnO组的HGB均明显下降(P＜0.05)；仅30 nm ZnO的WBC增加(P＜0.05)。与常规ZnO组比较，30、50 nm ZnO组的HGB下降，而PLT明显升高(P＜0.05)，30 nm ZnO组的WBC显著升高(P＜0.05)。

表3 不同种类ZnO染毒对大鼠血象指标的影响(，n=8)

表3 不同种类ZnO染毒对大鼠血象指标的影响(，n=8)

与对照组相比，*P＜0.05；与常规ZnO组相比，#P＜0.05.

组别 -6 RBC(10/μL) HGB(g/dL) -3 WBC(10/μL) NEUT(%) LYMPH(%) MONO(%) PLT(μL/L)纳米ZnO 30 nm 9.48±0.63* ，#139.00±4.28* ，#10.37±2.61* 27.40±7.57* 68.24±7.52* 3.05±1.09 ，#1.82±0.23*50 nm 9.50±0.76* ，#133.88±6.66* 9.62±3.29 35.21±9.58* 59.81±9.73* 3.54±0.94 ，#1.88±0.16*100 nm 9.36±0.40* 149.25±4.56 9.67±4.32 27.80±8.12* 67.18±7.60* 3.50±0.62 1.62±0.15*常规ZnO 9.14±0.73* 148.50±5.10 6.30±2.29 30.38±9.56* 65.19±10.20* 3.41±1.14 1.57±0.08*对照组 8.59±0.57 145.88±4.42 6.26±1.85 14.43±2.55 80.40±3.56 4.09±1.42 1.35±0.13

2.4 血清生化指标

由表4可见，与对照组比较，3种粒径纳米ZnO组和常规ZnO组的ALT均下降(P＜0.05)，AST/ALT值升高(P＜0.05)；30 nm ZnO组的BUN升高(P＜0.05)。与常规ZnO组比较，3种粒径纳米ZnO组的BUN均上升(P＜0.05)；30和50 nm ZnO组的AST均下降(P＜0.05)。各组间血清CRE含量差异均无统计学意义(P均＞0.05)。

表4 不同种类ZnO染毒对大鼠血清生化学指标的影响(，n=8)

表4 不同种类ZnO染毒对大鼠血清生化学指标的影响(，n=8)

与对照组相比，*P＜0.05；与常规ZnO组相比，P＜0.05.

组别 ALT(U/L) AST(U/L) AST/ALT BUN(mmol/L) CRE(μmol/L)纳米ZnO 30 nm 468.86±140.21* #1 187.57±91.79 2.69±0.70*7.40±0.93* 30.83±3.31 50 nm 484.38±60.04* #，#1 153.75±138.68 2.40±0.26* #7.01±1.16 30.01±2.95 100 nm 511.75±50.71* 1 284.12±95.93 2.52±0.22* #7.11±1.10 29.28±4.38常规ZnO 520.63±93.05* 1 338.13±105.10 2.67±0.57* 6.15±1.25 30.28±10.55对照组 662.63±80.46 1 276.13±76.36 1.94±0.18 6.38±0.97 28.08±3.50

2.5 精子畸形情况

由表5可见，仅30及50 nm ZnO组诱发的精子畸形率高于对照组，差异均有统计学意义(P均＜0.05)。纳米ZnO引起的精子形态改变有：无定形、无钩、香蕉形、胖头、尾折叠等。

表5 不同种类ZnO染毒对雄性大鼠精子畸形的影响(，n=4)

表5 不同种类ZnO染毒对雄性大鼠精子畸形的影响(，n=4)

与对照组相比，*P＜0.05.

组别 受检精子总数(个) 畸形精子数(个) 畸形率(%)纳米ZnO 30 nm 4 200 44 1.05±0.29*50 nm 4 458 26 0.81±0.27*100 nm 4 128 30 0.73±0.23常规ZnO 4 094 26 0.63±0.20对照组 4 462 11 0.24±0.20

2.6 大鼠脏器的组织病理学观察

睾丸组织除对照组和常规ZnO组各级生精细胞层次清晰外(图1A和1B)，3种纳米ZnO均对大鼠睾丸组织有明显影响。100 nm ZnO组管壁上生精细胞数量少于对照组，层次稍微减少，排列稍紊乱(图1C)；50 nm ZnO组睾丸组织管壁上生精细胞数量明显少于对照组，层次亦明显减少，排列紊乱，分层不明显，形成不规则空隙，但睾丸间质未见炎细胞浸润(图1D)；30 nm ZnO组睾丸组织管壁上生精细胞数量明显少于对照组，管腔内精子极少，个别曲细精管内仅见紧靠基膜的支持细胞及精原细胞，而其余各级生精细胞及精子消失，表现为生精阻滞，曲细精管内生精细胞部分脱落，阻塞于管腔内，或生精细胞排列紊乱，但睾丸间质未见炎细胞浸润(图1E)。其余各染毒组的肝脏、肾脏、脾脏、肺脏均未见明显组织病理学改变。

2.7 大鼠睾丸组织细胞凋亡情况

TUNEL检测显示，正常大鼠生精小管偶见生精细胞凋亡(图2A)，纳米ZnO组细胞凋亡明显，凋亡细胞核呈棕褐色，核呈固缩状、或染色质向周边聚集、或呈核碎片状，大多数凋亡为初级精母细胞(图2B～2E)。由图2F可见，纳米ZnO各组凋亡指数与对照组比较均升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，且凋亡指数随着纳米ZnO粒径的下降而上升(P＜0.05)。而常规ZnO组与对照组的细胞凋亡指数差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

现有的短期体内或体外毒性研究资料表明，纳米ZnO的作用靶器官是肝脏[11-12]， Li等[8]的研究结果表明采用口服或者腹腔注射的方式可导致纳米ZnO在肝、肺、脾和肾中积累，纳米ZnO还可能引起炎症，肝细胞坏死和脱落[13]。本研究结果显示，纳米ZnO可导致肝、脾、肾多个脏器系数改变，且粒径越小的纳米ZnO受影响的脏器越多，如30 nm ZnO组肝、脾、肾的脏器系数均升高，而50和100 nm ZnO组均只有一个脏器系数改变。另外，纳米ZnO导致的脏器系数的脏器与常规ZnO有差异。推测与纳米ZnO的表面效应、体积效应和量子尺寸效应有关[11]。

本研究的血象指标显示，纳米ZnO和常规ZnO均可引起骨髓红细胞增生活跃的增生性贫血现象，但纳米ZnO明显比常规ZnO严重，并且纳米ZnO的作用有随粒径下降而增强的趋势。以往研究表明，过量的常规锌和锌化合物会诱发机体产生贫血[14-15]。推测动物过量摄入锌会阻碍机体吸收铜和铁，从而导致生长障碍和贫血。本研究还发现，纳米ZnO和常规ZnO组的LYMPH及NEUT比例较对照组均显著变化(P＜0.05)，30 nm ZnO组的WBC数与对照组和常规ZnO组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。研究还观察到纳米ZnO和常规ZnO组均能诱导PLT显著升高(P＜0.05)，血小板数有随着粒径下降而增高的趋势。对于血小板数的改变可能是由于大鼠出现增生性贫血、骨髓造血活跃，导致血小板增生所致，但对于上述白细胞的改变，因无其他证据，原因尚不清楚。

血清生化学指标显示，与对照组比较，30 nm ZnO组的肝、肾功能均有明显改变，其他粒径纳米ZnO和常规ZnO仅有肝功能的轻度改变。Wang等[14]在一次灌胃给予5 g/kg纳米ZnO和常规ZnO对小鼠的急性毒性作用的比较中观察到纳米和常规ZnO均可能导致肝、肾功能改变，常规ZnO对肝功能的影响比纳米ZnO严重，而对肾功能的影响两者无明显差别。这是由于大小鼠的种间差异还是由于剂量和作用时间的差异所致有待进一步研究。但研究结果均提示肝、肾可能是纳米ZnO的作用靶器官。

图1 不同种类ZnO染毒后睾丸的组织病理学改变(HE，×400)

图2 不同ZnO染毒组大鼠睾丸生精细胞的凋亡情况(DAB，×400)

本研究还观察到，3种粒径纳米ZnO组导致睾丸组织细胞排列紊乱，分层不明显，形成不规则空隙，TUNEL法检测可见生精细胞的凋亡，而对照组和常规ZnO组无明显病理改变和生精细胞凋亡。30 nm和50 nm ZnO组还可导致精子畸形率增高。郭利利等[10]采用隔天腹腔注射200和500 mg/kg的纳米ZnO(直径30 nm)共5次，停药1周后，观察其对雄性ICR小鼠的急性毒性。结果也发现，活精子率降低、精子畸形率升高(P＜0.05)；500 mg/kg组上述指标变化差异均有统计学意义(P＜0.05)。TUNEL检测显示，纳米ZnO处理后睾丸生精细胞凋亡率增加(P＜0.05)。研究结果表明睾丸是腹腔注射暴露条件下纳米ZnO较为敏感的靶器官。

综上所述，纳米ZnO的亚慢性毒性明显高于常规ZnO；纳米ZnO的作用靶器官可能是睾丸、肝、骨髓和肾；且有随着粒径的降低，受影响的器官数和损伤程度加重的趋势。而常规ZnO的作用靶器官是骨髓，另外肝、肾和肺也有可能，但还需要进一步验证。

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