肺腺癌患者新鲜细胞学标本EGFR基因突变检测及意义

郭 晓，王 蕊，吴 娟，纪晓坤，王 珩，张 艳，马 阳，杜 芸*

（河北医科大学第四医院癌检中心，河北 石 家庄 050011）

表皮生长因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，在肺腺癌中突变率较高。2015年美国国立综合癌症网络(national comprehensive cancer network，NCCN)建议对晚期的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者进行EGFR基因常规检测，对于敏感突变患者推荐靶向药物作为一线治疗[1]。目前，用于EGFR基因突变检测的标本大多采用肿瘤组织的石蜡标本[2]，但晚期患者很难获得，而此类患者常伴随远处体表淋巴结转移和胸腔积液，细胞学标本的获取相对容易且数量充足。本研究通过细针穿刺和抽取胸腔积液获得新鲜细胞学标本，经HE染色、免疫细胞化学明确诊断后进行EGFR基因突变检测，EGFR基因突变阳性的患者服用酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)或进行化疗，评估其预后。探讨采用新鲜细胞学标本进行EGFR基因突变检测的可行性和临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2013年1月至2015年1月河北医科大学第四医院癌检中心要求行EGFR基因突变检测的313例晚期肺腺癌患者新鲜细胞学标本及病历资料，男性患者161例，女性患者152例；年龄28～89岁，平均年龄为60岁，其中≥60岁169例，＜60岁的144例；细针穿刺标本112例，胸腔积液标本201例。预后评估的纳入标准：新鲜细胞学标本检测EGFR阳性，无20号外显子突变；有完整病例资料；无肺外原发性肿瘤；根据实体瘤疗效评价标准(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)，有明确可评估和测量的病灶；服用一线药物后生存期≥1个月。

1.2 标本采集及处理

1.2.1 针吸标本采集及处理 细针穿入淋巴结负压抽取少量内容物，一部分注入1.5 mL的EP管，置于-20℃冰箱保存，用于EGFR基因突变检测；剩余部分制作10张细胞涂片，2张采用普通玻片用于常规诊断，8张采用防脱玻片用于免疫细胞化学诊断，均置于95%乙醇中固定。

1.2.2 胸腔积液标本采集及处理 将送检胸腔积液分成两部分：一部分胸腔积液(约100～200 mL)倒入20 mL离心管，1 800 r/min离心2 min，弃上清，留取底层沉淀物，重复倒入离心管，直至将这部分胸腔积液全部离心完毕，最后一次留取5 mL上清液，混匀，置于-20 ℃冰箱保存，用于EGFR基因突变检测；剩余胸腔积液用一次性病变细胞采集器富集细胞后，将载有细胞的膜片均匀地涂于10张载玻片，用途和固定同上。

以上标本经HE染色找到癌细胞且癌细胞占整张玻片上细胞总数的比例≥25%后进行免疫细胞化学染色。

1.3 免疫细胞化学

结合临床资料和其他影像学检查结果，选择NapsinA、TTF-1、CEA、CK7、CK5/6、P63、P40、Syn、CD56、E-cadherin、CR等抗体，采用SP法进行免疫细胞化学染色：将防脱玻片从固定液中取出，风干后水洗，置于过氧化氢中15 min；充分水洗后，抗原修复；滴加动物非免疫血清，室温孵育15 min；弃去多余血清后加一抗，4 ℃过夜；PBS冲洗，加二抗，孵育20 min；PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染细胞核，然后酒精分化、氨水返蓝、梯度酒精脱水。吹干，中性树胶封片。

免疫细胞化学标记后观察目的细胞，抗体着色的位置准确，在相应部位出现明显棕黄色或者棕褐色颗粒才可判定为阳性。

1.4 EGFR基因突变检测

1.4.1 DNA提取 采用德国QIAGEN公司提取新鲜细胞学标本DNA的试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)，经消化、结合、洗涤、洗脱等步骤在紫外线分光光度计下检测DNA样本的纯度和浓度，确保其纯度在1.7～2.1、浓度在2～10 ng/µL。

1.4.2 EGFR基因突变检测 使用武汉海吉力生物科技有限公司研发的人类EGFR基因突变检测试剂盒进行检测。该试剂盒采用扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)技术进行实时荧光定量PCR，检测人类EGFR基因外显子18～21上的突变。主要步骤：将待测的DNA样品、阴性对照和阳性对照各取40 µL，分别加入4 µL热启动Taq DNA聚合酶，瞬时离心混匀后，依次取5 µL加入试剂盒的8联条后，置于ABI7500实时荧光定量PCR仪中，按照说明书设置程序。

1.4.3 检测结果判读 PCR仪收集到的信号应满足以下条件才能认为结果可信：①阴性对照无FAM信号升起；②阳性对照FAM信号CT值 应符合10≤CT≤ 20；③外控反应孔(EGFR 8联PCR反应条的第8孔)的FAM信号CT值 应符合10≤CT≤ 25。

此试剂盒采用ΔCT值 来判断样本的结果。每个样本检测完成后均有7个检测体系对应的突变信号(FAM)CT值 和内控信号(JOE/VIC)CT值 ，还有1个外控信号(FAM)CT值 。若突变信号CT值 ＞30，则检测结果为阴性。若突变信号CT值≤30，则应计算检测体系与外控检测体系FAM信号之间的ΔCT值 。EGFR基因的突变分布在18～21号外显子上，因此可能存在多种突变共存的情况(见表1)。

表1 EGFR基因突变含量判断

1.5 预后评估

将EGFR基因突变阳性的患者按1.1中所述纳入标准筛选，根据一线用药情况分成两组，即靶向治疗组和化疗组。靶向治疗组：口服厄洛替尼150 mg/d或者吉非替尼250 mg/d。化疗组：顺铂30 mg/m2，第1～3天静脉滴注；紫杉醇135 mg/m2，第1天静脉滴注，每3周为1个疗程。所有入组患者接受治疗直至出现疾病进展或者不可耐受的副反应，期间每3个月随访一次，观察患者的客观有效率(objective response rate，ORR)和无进展生存期(progression free survival，PFS)。

1.6 统计分析

运用SPSS 16.0统计分析软件，χ2检验评价ORR，Kaplan-Meier曲线进行PFS的分析。

2 结果

2.1 HE染色和免疫细胞化学染色结果

313例患者中，找到癌细胞297例。找到癌细胞的患者中，确诊为肺腺癌293例。

2.2 EGFR基因突变检测结果

293例肺腺癌患者，288例提取DNA成功，提取成功率约为98.3%。这288例患者进行EGFR基因突变检测，发生基因突变130例，突变率为45.1%。其中18号外显子突变的5例，占3.8%；19号外显子突变60例，占46.2%；20号外显子突变5例，占3.8%；21号外显子突变60例，占60%。EGFR突变与患者的临床特征关系见表2。

表2 EGFR突变与临床特征的关系

2.3 预后

截止到2016年1月，符合纳入标准的93例EGFR阳性患者中，中位随访时间14个月，共死亡54例。靶向治疗组和化疗组ORR的差异具有统计学意义(χ2≈24.544，P＜0.01)，即靶向治疗组的疗效优于化疗组(见表3)。靶向治疗组和化疗组的中位PFS分别为9.5个月和6个月，从图1中可看出靶向治疗组曲线在化疗组之上，即靶向治疗组的无进展生存期长于化疗组。

表3 3组NSCLC患者的疗效比较

3 讨论

当今，肺癌严重威胁人类的健康，是发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一，而非小细胞肺癌又是肺癌中最常见的类型[3]。由于发病隐匿，大部分患者首次就诊时已是晚期，失去了手术机会，预后较差。以铂类为基础的化疗虽然是治疗晚期非小细胞肺癌的标准用药，但是可引起骨髓抑制、肝肾损害等毒副作用，极大地降低了患者的生存质量[4]。随着肿瘤分子生物学的发展，靶向治疗以其选择性高、副作用小、疗效好的特点[5-7]，占据了越来越重要的地位。但是靶向药物价格比较昂贵且并不会使所有的用药患者都受益，只有选择合适的靶点才能为肺癌的个体化治疗提供依据。EGFR基因突变在我国非小细胞肺癌中最常见[8]，该靶点的研究也成为最近的热点。目前，EGFR 基因突变检测大多为手术切除石蜡包埋的肿瘤组织标本。对于晚期失去手术机会的肺癌患者很难获得，因此，寻求一种替代标本进行EGFR基因突变检测已成为当务之急。

由于EGFR基因突变有一定的人群优势，多发生在女性、不吸烟、肺腺癌的患者中[9]，因此对于体表淋巴结肿大和胸腔积液，应先明确性质和来源。体表淋巴结肿大在晚期肺癌患者中较常见，仅凭肿大淋巴结的位置、外观和影像学检测很难确定其性质，其原发部位也可以是全身各处。胸腔积液也在肺部疾病中较常见，尤其在肺腺癌中更加多见，但常规的细胞学检查主要依赖于癌细胞的形态学特点，由于癌细胞在积液中失去了原有的组织形态，加之间皮细胞受刺激反应性增生也有一些“癌细胞”的形态学特点，因此仅依赖形态学也很难作出判断，这就需要免疫细胞化学辅助诊断。同时在新鲜细胞学标本中可能混有较多的非肿瘤细胞，因此需要一种敏感性高的方法，ARMS 法所需肿瘤组织量小，10 ng基因组背景下突变含量为1%的DNA样本[10]，就可以测定EGFR的突变情况。因此通过细针穿刺和抽取胸腔积液获得的新鲜细胞学标本，操作简单易行、损伤小、费用低、可重复性好、标本来源充足且便于收集，一定程度上可以解决标本获取的问题。

本研究的288例新鲜细胞学标本，18～21号外显子总的突变率为45.1%(130/288)，与文献[11]报道的EGFR基因的突变率为36.4%～66.3%基本一致。Kasaka等[12]、 Paez等[13]和 Lynch等[14]报道90%的EGFR突变发生在19号外显子和20号外显子上，本研究发生19和21号外显子突变120例，两者之和突变率占92.4%(120/288)，与报道也一致。同时结合新鲜细胞学检测的EGFR阳性患者靶向治疗组的客观有效率和无进展生存期优于化疗组，与IPASS研究[15]、NEJGSG002研究[16]、 WJTOG3405研究[17]以 及OPTIMAL研究相同[18]，可以得出，新鲜细胞学标本作为EGFR的检测标本结果准确。

综上所述，在临床上无法获得肿瘤细胞标本的情况下，采用新鲜细胞学标本作为该标本的替代标本是行之有效的。

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