亚硝胺及前体化合物的致癌效应及其食用安全性研究进展

徐 淼张倩男杨 辉 * 张立实 贾旭东*

( 1．四川大学华西公共卫生学院，四川 成 都 610041；2．卫生部食品安全风险评估重点实验室，国家食品安全风险评估中心，北京 100021 )

亚硝胺是环境中常见的一类化学致癌物，在食物、饮用水、烟草、酒精饮料、化妆品中广泛存在。就食源性污染而言，亚硝胺常源于熏肉、烤肉、咸鱼等肉类食品的加工；此外，膳食摄入的硝酸盐和亚硝酸盐能够在体内转变为亚硝胺[1-2]。 我国食品安全国家标准《GB 2760-2014 食品添加剂使用标准》允许硝酸盐、亚硝酸盐作为食品添加剂在食品工业中使用，随着其使用量日益增加，亚硝胺体内暴露水平相应地也会潜在增加。亚硝胺能够在不同种属动物中诱发肿瘤，但目前关于其致癌性的人体研究资料不足。越来越多的流行病学研究发现，世界不同地区人群的食管癌和胃癌发病风险与亚硝胺及前体化合物的膳食摄入量密切相关[3-6]。因此，作为一种重要的食源性危害因素，亚硝胺致癌效应及暴露水平研究资料的更新积累对于我国人群亚硝胺及前体化合物的食用安全风险评估至关重要。本文就亚硝胺致癌效应研究进展及国内外相关食品安全管理现状进行综述。

1 亚硝胺的来源

1.1 外源性摄入

食品生产加工过程和保藏方式如添加防腐剂、熏制、腌制等是亚硝胺食品污染的主要来源[7]。硝酸盐和亚硝酸盐是被广泛使用的防腐剂、护色剂，常用于加工类肉食品的制作和保藏，它们是亚硝胺的主要前体化合物。常见的烹调方式如油炸、煎制、烟熏等易使食物中的胺类化合物发生亚硝化作用产生亚硝胺[8]。例如，油炸和煎制可使干腌香肠中亚硝胺的含量增加30%[8]；熏肉尤其是培根经烹调后亚硝基化合物(N-nitroso compounds，NOC)可达到10～100 μg/kg，日本烟熏鱼肉中二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，NDMA)甚至超过100 μg/kg[9]。使用燃烧烟气干燥麦芽、香辛料时也可产生亚硝胺，用麦芽发酵的啤酒中NDMA含量可高达70 μg/L[9]。有调查显示，我国广东地区2016年市售腊肠总挥发性亚硝胺含量为1.85～15.32 μg/kg[10]。此外，腌制和盐制蔬菜或肉制品等储存不当时，天然食材中的硝酸盐会经微生物还原为亚硝酸盐，继而可能促进亚硝胺的形成[7，11]。

1.2 内源性合成

除食品添加剂外，在蔬菜、奶类、鱼类、肉类中等食物中存在较多天然的硝酸盐、亚硝酸盐、氮类等亚硝胺前体化合物。这些前体物在人体胃酸环境中可与蛋白质代谢产生的胺类化合物作用形成NDMA、亚硝酰胺等亚硝基化合物[1，9]。因此，硝酸盐、亚硝酸盐的膳食摄入可能导致亚硝胺的人体内暴露水平潜在增加，但目前缺乏相应的人群研究资料。体外模拟胃肠道生理条件的动态模型研究显示，人体摄入10倍每日容许摄入量(acceptable daily intake，ADI)的硝酸盐和100 g的鱼肉，即使胃液pH缓慢变化，内源性NDMA水平仍可达到43 μg[2]，远高于外源性摄入水平。根据世界癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)报告(2010年)，经口摄入的硝酸盐或亚硝酸盐在内源性亚硝化作用下可能对人体造成致癌效应。2015年，我国上海的一项人群队列研究发现，胃癌发病风险与尿液中硝酸盐水平显著相关，而且尿液中NOC水平与膳食中腌制蔬菜的摄入量具有明显的剂量依赖关系[12]。

2 亚硝胺的致癌效应

2.1 动物致癌性试验研究

IARC早在1987年就将某些种类亚硝胺(如二甲基亚硝胺、二乙基亚硝胺)列为2A类致癌物(对实验动物致癌性证据充分，但对人类致癌性证据有限)。动物试验研究表明，亚硝胺类化合物几乎可以诱发所有脏器肿瘤，但以消化系统肿瘤最为常见。长久以来，学术界已利用亚硝胺的致癌性构建了多种动物肿瘤模型用于癌症研究。例如，通过给ICR小鼠腹腔注射35 mg/kg二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)每周1次，连续8周，40周时经组织病理确定的肝细胞癌发生率为37.5%[13]； Marcelo等[14]研究者利用DEN的致癌性，每周前4天通过饮用水给予40 mg/L的DEN，持续180 d，小鼠胃癌的发生率可达63%；本实验室利用甲基苄基亚硝胺(N-methyl-benzyl-nitrosamine，NMBA)建立大鼠食管癌模型，0.5 mg/kg颈部皮下注射，每周3次，连续5周，第10周时肿瘤发生率为50%，至25周时肿瘤发生率为100%[15]。

2.2 人群流行病学研究

2012年全球发病率前10位的癌症中包含3种消化道肿瘤：结肠癌(第3位)、胃癌(第5位)、食管癌(第8位)；而在我国这3种消化道肿瘤占总癌症新发病例的1/3，其中食管癌和胃癌的发病人数分别占全球病例的49%和43%[16]。病因学分析表明，导致胃癌的主要危险因素除幽门螺旋杆菌感染外，还来自饮食，特别是腌菜和烤肉、熏肉的摄入[17]。同样，此类食物的膳食摄入量较高也是诱发食管鳞状上皮细胞癌的重要危险因素之一。

近年来，亚硝胺及其前体化合物的膳食暴露与消化道肿瘤发病的相关性得到了学术界的广泛关注。胃液中亚硝基化合物及其前体物含量较高可能是致胃癌发病的重要原因。一项欧洲的前瞻性研究发现内源性NOC的生成可能是非贲门胃癌的危险因素[18]，而2011年在英国的队列研究结果表明胃肠道癌症特别是直肠癌的发病率升高与内源性NOC无关而与NDMA膳食暴露有关[5]。在荷兰完成的大型前瞻性队列研究发现，NDMA和亚硝酸盐的膳食暴露水平与食管鳞癌的发病风险密切相关[6]。北美地区的病例对照研究提示，NDMA的膳食暴露可能增加结肠癌的发病风险[19]。同样，我国东南沿海、河南林县等地区食管癌发病率较高也可能与人群亚硝胺暴露水平较高有关[20]。

有学者对亚硝胺暴露与消化道肿瘤的相关性研究进行了Meta分析。Ren等[17]搜集了东亚国家的人群研究，通过分析发现食用腌制食品可显著增加胃癌的风险，喜食腌制食物较不常食用腌制食物的人群患胃癌的风险增加了近50%，尤其是在中国和韩国。崔娟等[4]分析了1980～2012年的队列研究，发现NDMA膳食暴露可显著增加消化道肿瘤的发病风险。Song等[3]发现硝酸盐与亚硝酸盐、亚硝胺对胃癌的发病风险有不同效应，高硝酸盐摄入可在一定程度上降低胃癌发病风险，这可能是因为硝酸盐主要来源于蔬菜，而蔬菜富含膳食纤维、维生素C及其他抗氧化剂，可减少致癌性NOC形成；但膳食高摄入亚硝酸盐、NDMA可增加胃癌风险，与崔娟等[4]研究结果一致。

3 亚硝胺致癌机制研究进展

3.1 传统的致癌机制研究

自然界中存在300多种亚硝胺，因结构(对称、非对称及环状)和代谢特征的差异使其致癌性表现出明显的组织特异性，但一般认为其共同的作用机制通常包括3个生物学过程：①亚硝胺在靶器官或组织中代谢活化生成烷基化阳离子；②DNA烷基化造成遗传损伤并诱导修复；③DNA修复无效导致基因突变及细胞恶性转化。例如，NMBA能够特异性诱导大鼠产生食管鳞癌，它在动物体内经代谢活化后最终形成甲基正碳离子(CH3+)，与DNA作用后形成加合物O6-甲基鸟嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。当DNA甲基化加合物无法被甲基转移酶(MGMT)有效清除时，可以造成RAS、P53等基因突变并最终诱发癌症[21]。少量样本的人体研究发现，胃癌组织中O6-甲基鸟嘌呤含量显著高于正常组织，而且与病人的硝酸盐和亚硝胺膳食摄入量密切相关[22]。

3.2 可能的新机制——炎症微环境塑造

虽然传统观念认为亚硝胺的致突变性是其致癌效应的重要分子机制，但这一“细胞内”(intracellular)反应并非其诱发肿瘤的唯一决定因素。近年来，越来越多的研究证明慢性炎症反应在肿瘤发展的不同阶段均起到了关键作用[23]。炎症反应源于机体免疫应答，组织微环境中浸润的免疫细胞与肿瘤细胞产生动态、广泛而长久的相互影响，共同塑造炎症微环境并最终决定癌症结局。炎症微环境已经被证实为肿瘤形成的必要条件，特别是在消化道肿瘤中[24]。在亚硝胺致消化道肿瘤的有害结局路径(adverse outcome pathway，AOP)中，起始分子事件(molecular initiating events，MIEs)除正碳离子导致的DNA烷基化外还包含氧自由基(ROS)、氮自由基(RNS)产生的DNA氧化损伤和蛋白氧化修饰[25]。氧化应激信号途径的激活能够促使细胞分泌趋化因子、启动免疫应答，继而诱发机体产生有利(组织修复)抑或有害(炎症损伤)反应[26]。利用体外肠细胞模型进行的转录组学分析表明，不同种类的亚硝胺暴露使氧化应激和炎症反应信号通路显著激活[27]。炎性细胞浸润可产生ROS、RNS进而增加DNA损伤，导致细胞生存(cell survival)或抗凋亡(anti-apoptotic)信号通路激活和癌基因转录表达，促进上皮细胞转化。另一方面，炎症微环境中免疫细胞分泌的白细胞介素(IL-1，IL-6，IL-17，IL-23)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、肿瘤生长因子(TGF-β)、内皮细胞生长因子(VEGF)等细胞因子能够进入基质细胞并激活某些核转录因子(NF-kB、STAT3、AP-1等)，从而促进局部血管生成以及肿瘤细胞增殖、迁移或侵袭[28]。“细胞外”免疫响应过程与传统认识中的“细胞内”反应的相互关系，以及肿瘤微环境中上皮细胞与免疫细胞如何相互作用等问题有待深入研究。

3.3 影响亚硝胺致癌性的其他因素

动物实验和流行病学研究表现，维生素C(vitamin C，VC)和维生素E(vitamin E，VE)能够阻断亚硝胺的合成，从而可能降低消化道肿瘤的发病风险。早在1986年就有研究报道，VC和VE可抑制亚硝化作用从而减少亚硝胺合成。一项意大利的病例对照研究发现，VC、VE的摄入可降低NOC所导致的胃癌发病风险。另一巢式病例对照研究同样表明，机体维生素C水平对于NDMA膳食暴露的致癌效应(尤其是直肠癌)可能具有显著影响[5，18]。

相反，某些膳食营养元素缺乏可能促进亚硝胺的致癌效应。Fong等[29]发现，膳食中锌缺乏可能会促进NMBA对大鼠食管的致癌效应，而补充锌则可促进癌细胞凋亡，延缓肿瘤进展。本实验室通过动物模型模拟了我国林县人群VE和硒营养缺乏状态对NMBA诱发食管癌的促进作用，并证实了膳食补充VE和硒的化学预防作用[15]。由此可见，食物与营养对于亚硝胺的致癌风险具有重要影响，而补充微量营养元素可能是预防消化道肿瘤的有效方法[30]。

4 亚硝胺相关的食品安全标准

2016年，IARC已将加工肉类食品(processed meat)列为1类致癌物。亚硝胺作为该类食品的重要污染物之一，针对其制订有关卫生标准并实施监管，对于减少食源性危害，保护人群健康具有重要意义。美国农业部规定，肉制品中总挥发性亚硝胺不得超过10 μg/kg；FDA规定了麦芽中NDMA含量不超过10 ppm，而麦芽饮料中不得超过5 ppm。我国食品安全国家标准《GB 2762-2012 食品中污染物限量》规定了蔬菜、饮用水、乳类及特殊用途食品等食品中亚硝胺、亚硝酸盐和硝酸盐的残留限量，例如肉制品(肉类罐头除外)中NDMA不得超过3.0 μg/kg，水产制品(水产品罐头除外)不得超过4.0 μg/kg。

(亚)硝酸钠、(亚)硝酸钾是常用于肉制品、海产品的防腐剂、护色剂，是加工肉制品中亚硝酸盐的主要来源。国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission，CAC)规定加工畜禽肉制品时亚硝酸盐的最大使用量为80 mg/kg。日本对于硝酸钾、硝酸钠作为肉制品护色剂的使用限量标准为70 mg/kg，亚硝酸钠作为肉制品护色剂则要求使用后亚硝酸盐残留量不超过5 mg/kg。我国食品安全国家标准《GB 2760-2014 食品添加剂使用卫生标准》对硝酸盐、亚硝酸盐的使用也作出了明确的限量规定，如硝酸钠、硝酸钾作为护色剂、防腐剂使用时，腌腊肉制品类最大使用量为0.5 g/kg，亚硝酸钠、亚硝酸钾最大使用量为150 mg/kg，残留限量不得超过30 mg/kg。

5 亚硝胺及前体化合物的暴露评估

目前，亚硝胺人体暴露评估大多是通过检测食物中最常见的类型NDMA来实现，但由于内暴露尚未引起足够重视，而且相应的检测分析方法尚不完善，因此亚硝胺内源性暴露水平的研究资料非常有限。世界卫生组织(WHO)2002年报告显示，NDMA的人体暴露主要来自食物的加工处理或保藏过程，成人(20～59岁)通过食物的暴露量为4.3～11 ng/(kg·d)；这一暴露评估主要基于加拿大人群的食物摄入量和NDMA污染水平进行估算[7]。2009年，美国学者通过调查问卷分析得到NOC膳食暴露水平范围为0.001～15 μg/d[31]。有研究者根据NDMA诱发肝脏肿瘤的毒性效应利用基准剂量法(Benchmark dose，BMD)推算出其每日耐受摄入量(tolerable d aily i ntake，TDI)为4.0～9.3 n g/(kg·d)[32]。虽然研究资料有限，但可以推断亚硝胺的总体外暴露水平很可能超出人体耐受摄入量从而增加癌症风险。

关于亚硝胺前体物，2003年WHO提出的硝酸盐每日容许摄入量(ADI)为3.7 mg/kg，亚硝酸盐为0.07 mg/kg。基于有限的研究资料，WHO报告显示硝酸盐、亚硝酸盐的人群暴露水平不太可能超过ADI[33]。但是，由前体化合物内源性合成亚硝胺的实际内暴露水平尚不清楚，其食品安全风险评估资料更是缺乏。Zeilmaker等[34]利用体外肠细胞模型推算了荷兰人群的NDMA内暴露水平[成人0.4 ng/(kg·d)]，并推断同时摄入鱼和硝酸盐高含量的蔬菜可能增加癌症风险。

6 问题与展望

近年来，亚硝酸盐、硝酸盐作为食品添加剂在食品工业中广泛使用，亚硝胺总体膳食暴露水平可能相应地潜在增加，但目前缺乏完整的风险监测和暴露评估资料。亚硝胺致癌效应机制尚未完全明确，亚硝胺及其前体化合物与人体消化道肿瘤的相关性还有待进一步研究证实。亚硝胺的人体内暴露水平及健康影响效应仍缺乏准确的生物标志物和监测方法。作为一种重要的食源性危害因素，亚硝胺的人体膳食暴露水平、机体内暴露水平及其致癌效应研究资料的更新积累对于我国人群亚硝胺、(亚)硝酸盐的食品安全风险评估至关重要。

另一方面，亚硝胺致癌性受其遗传毒性和机体稳态平衡的共同作用。利用现代毒理学技术研究亚硝胺致癌效应中机体免疫细胞行为、发现毒性通路中关键分子事件并探索靶向干预措施成为该领域内的重要研究方向，也将为消化道肿瘤的化学预防、减少疾病负担提供科学支持。

在食品生产加工方面，从源头上减少硝酸盐、亚硝酸盐的使用或寻求替代品将是减少其膳食暴露的有效途径。目前，已有许多研究在寻找可部分或完全替代亚硝酸盐的添加剂或能够阻断亚硝胺产生的物质，例如红曲色素(发色剂)、乳酸链球菌素(防腐剂)、茶多酚(抗氧化剂)、姜蒜汁和α-生育酚(亚硝胺生成阻断剂)[35]。但(亚)硝酸盐在肉制品生产过程中仍是广泛使用的食品添加剂，未来应加强对此类替代品的应用及安全性研究。

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