延胡索叔胺碱和季胺碱对豚鼠心室肌细胞动作电位和HERG通道电流的影响

孟红旭 姚明江 任钧国 刘建勋

(中国中医科学院西苑医院基础医学研究所,中药药理北京市重点实验室，北京,100091)

延胡索又名元胡、玄胡索等，为罂粟科紫堇属植物延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)的干燥块茎，具有活血、行气、镇痛等功用，用于胸胁、脘腹疼痛、经闭痛经、产后瘀阻等，现在临床主要集中用于心律失常、冠心病心绞痛、气滞血瘀诸痛[1-4]。目前认为延胡索主要活性部位分是延胡索碱，主要分为叔胺碱和季胺碱。研究报道叔胺碱和季胺碱房性早搏、交界性早搏具有较好的治疗作用，并发现叔胺碱与奎尼丁对心电图的影响颇为相似，而季胺碱能够产生与乙胺碘呋酮相似的作用，这表明这2种生物碱在抗心律失常方面具有不同的作用特点，虽然后续的研究发现延胡索碱的一些单体化合物对心肌细胞的动作电位和钾通道产生一些效应，但是延胡索碱的抗心律失常机制仍不清楚[5-6]，本研究通过观察叔胺碱和季胺碱对豚鼠心肌细胞动作电位和HERG通道的影响从对离子通道角度探讨叔胺碱和季胺碱的作用机制和作用特点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康成年豚鼠(300 g)，由北京斯克贝实验动物科技有限公司提供(合格证号：SCXK(京)2011-0004)。

1.1.2 药物 季胺碱(中国科学院大连化物所馈赠,批号：20140821，总碱含量>90%)和叔胺碱(中国科学院大连化物所馈赠,批号：20140821总碱含量>60%)和特非那定(大连美仑生物技术有限公司，批号：S0425A)。

1.1.3 试剂与仪器 无钙台式液(mmol/L)：NaCl140，KCl 5.4，NaH2PO4 0.33，MgCl21，Glucose 10，Hepes 10(用NaOH调节至PH7.4)；KB液(mmol/L)：KOH 70，KCl 40，KH2PO420，Glutamic acid 50，MgCl23，Taurine 20，EGTA 0.5，Hepes 10，Glucose 10(用KOH调节至PH7.4)；测定动作电位电极内液(mmol/L)：KCl 140，Na2ATP 4，MgCl21，EGTA 5，HEPES 10，Glucose 10(用KOH调节至pH 7.2)；测定HERG电流电极内液(mmol/L)：KCl 130，MgCl21，MgATP 5，EGTA 5，HEPES 10，glucose 10(用KOH调节至pH 7.2)，除指定药品外全部从Sigma-Aldrich中国公司购入。(PULL-100美国)和膜片钳放大器(HEKA EPC10德国)。

1.1.4 豚鼠单个心室肌细胞的分离 豚鼠用20%乌拉坦10 mL/kg腹腔注射麻醉，迅速开腹取下心脏，在0 ℃无钙台式液的冰水混合液中去除脂肪以及多余组织，经主动脉逆行插管将心脏置于Langendorff灌流装置。用无钙台式液灌流心脏3～5 min，再用含酶(胶原酶Ⅰ0.3 g/L+蛋白酶E 0.1 g/L+牛血清白蛋白0.8 g/L)无钙台式液灌流1 min后，改成酶液环灌流4 min。剪下心室肌，在KB液中剪碎并轻轻吹打，用200目筛网过滤，贮存于4 ℃冰箱中待用。整个过程保持流入心脏的液体温度为37 ℃，同时保证离体心脏的暴露环境温度在22 ℃以上，各液体始终通以99.5%医用氧气。

1.2 方法

1.2.1 HERG-HEK293细胞的培养 将转染并稳定表达人源心肌HERG离子通道的HEK293细胞(河北医科大学药理室提供)复苏后接种于玻璃片上置于培养皿中，采用含10%胎牛血清DMEM培养基培养48 h。HERG通道蛋白由GFP荧光蛋白标记，在蓝色荧光激发下，发出绿色荧光，诱导出的电流能够被特非那定(1 μmol/L)阻断，证明为稳定表达HERG离子通道。见图3。

1.2.2 全细胞膜片钳记录 取一滴心室肌细胞悬液，置于倒置显微镜实验平台上的1 mL浴槽内，静置5 min使细胞充分贴附于浴槽底部，然后用台式液进行灌流，流速为2 mL/min，5 min后选择边缘整齐、横纹清晰、表面光洁、静止的杆状心室肌细胞进行实验。将HEK293细胞培养玻璃片直接置于细胞槽内，然后用台式液(CaCl22.0 mmol/L)进行灌流，选择三角形，折光性好的细胞进行实验。操作微操使玻璃微电极接触细胞膜负压形成高阻抗封接(兆欧封接)，吸破细胞膜形成全细胞记录状态。在PULSE软件控制下，数字脉冲经D/A转换成模拟电压或电流信号，再经膜片钳放大器放大，通过Ag-AgCl电极导入细胞，产生的电流或电压信号经膜片钳放大器输出，再经A/D转换，由计算机采集整理数据。实验在22 ℃室温下进行。

2 结果

2.1 季胺碱和叔胺碱对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响 膜片钳放大器在电流钳模式下记录单个心室肌细胞动作电位，给予细胞刺激电流(强度400～900 pA，持续10～35 ms)引发动作电位。给予叔胺碱(3、10 mg/L)后，动作电位未见明显变化(n=3)(图1A),给予叔胺碱(30、100 mg/L)可见动作电位时程明显延长，洗脱后部分恢复，静息电位和动作电位幅度未见明显变化(图1B)。测定ADP90(复极至90%动作电位时程)，将叔胺碱与灌流台式液(对照)指标进行比较，计算ADP90延长率(ADP90叔-ADP90台/ADP90台)，叔胺碱(30、100 mg/L)ADP90的延长率分别为(10.8±9.2)%(n=5)、(35.3±22.3)%(n=5)，差异有统计学意义(P<0.05)，表明叔胺碱延长动作电位时程具有浓度依赖性。给予季胺碱(1、3 mg/L)后，动作电位时程出现缩短，静息电位变深，动作电位幅度未见明显变化(n=4)(图2C);静息电位由(-68.2±10.5)mV变为(-71.1±11.1)mV(n=4,P<0.05)和(81.5±13.8)mV(n=4,P>0.05)。给予10 mg/L季胺碱(n=2)后对动作电位时程未见明显改变，给予季胺碱(30、100 mg/L)可见动作电位时程明显延长，洗脱后部分恢复，静息电位和动作电位振幅未见明显变化(图2B)，测定ADP90，将季胺碱与灌流台式液(对照)指标进行比较，计算缩短率(ADP90台-ADP90季/ADP90台)，30 mg/L和100 mg/L季胺碱缩减率分别为(5.4±2.5)%(n=4)，(7.6±6.2)%(n=4),差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 季胺碱和叔胺碱对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响

注：A.叔胺碱(3、10 mg/L);B. 叔胺碱(30、100 mg/L);C. 季胺碱(1、3 mg/L);D. 季胺碱(30、100 mg/L)

2.2 季胺碱和叔胺碱对HERG电流的影响 转染HERG通道的HEK293细胞，HERG通道蛋白由GFP荧光蛋白标记，在蓝色荧光激发下，发出绿色荧光，给予单刺激电压诱导出HERG电流，可被特非那定(1 μmol/L)所阻断。见图2。给予叔胺碱(3～300 mg/L)，HERG通道尾电流随浓度增加变化逐渐减弱，洗脱后部分恢复。一例不同浓度的叔胺碱对同一个细胞HERG通道电流的作用。见图3。将尾电流峰值作为观察指标，将给药后该指标与灌流台式液(对照)指标进行比较，计算抑制率(I台-I药/I台),其中叔胺碱(3、10、30、100、300mg/L)抑制率分别为：(6.4±5.3)%(n=4)、(15.1±8.7)%(n=4)、(31.6±10.2)%(n=7)、(80.2±10.3)%(n=6)、100%(n=2),采用logistic公式y=A2+(A1-A2)/[1+(x/x0)p]，A1、A2分别为最小和最大抑制率，x0为IC50，p为斜率)进行拟合，绘制量效曲线(图3)，计算出叔胺碱的IC50为(55±7.2)mg/L。给予叔胺碱(1、3 mg/L)灌流，HERG通道尾电流出现增强，洗脱后恢复，图4显示1例叔胺碱(1、3 mg/L)对同一个细胞HERG通道电流的作用。将尾电流峰值作为观察指标，计算增强率(I药-I台/I台),其中1 mg/L和3 mg/L季胺碱增强率分别为：(28.2±6.9)%(n=4)、(40.6±11.3)%(n=4)。给予叔胺碱(30、100、300 mg/L)灌流，HERG通道尾电流出现抑制，洗脱后恢复，图4显示一例叔胺碱(10、30、100 mg/L)对同一个细胞HERG通道电流的作用。30 、100 、300 mg/L季胺碱抑制率分别为：(39.4±6.7)%(n=4)、(84.7±0.7)%(n=2)、100%(n=2)。10 mg/L季胺碱呈现出对HERG通道电流的双向作用，2个细胞表现为增强效应，2个细胞表现为抑制效应。

图2 稳定转染HERG通道的HEK293细胞和特非那定的抑制作用

图3 叔胺碱对HERG通道电流的作用

图4 季胺碱对HERG通道电流的作用

3 讨论

现代药物化学和药理学实验表明，延胡索中的主要活性成分为叔胺和季铵型两类生物碱，其中叔胺碱含量约为0.65%，季铵碱含量约为0.3%[7]。这2类成分在结构、溶解性和药理作用上也有着很大的不同：以延胡索甲素，乙素，丙素，丁素等为代表的叔胺型生物碱几乎不溶于水，往往具有良好的镇痛镇静作用，是延胡索用于传统止痛治疗的主要活性成分，而延胡索在抗心肌缺血、减少心肌氧耗等方面的显著作用，主要是缘于而水溶性较好的季铵碱，其主要包括小檗碱型的黄连碱、小檗碱、脱氢紫堇碱、非洲防己胺等[8-10]。早在上世纪八十年代马胜兴、陈可冀等发现延胡索碱具有治疗快速性心律失常的作用，而且叔胺碱和季铵碱对心电图产生不同影响：叔胺碱能够引起心电图P、QRS波增宽和P-R、Q-T间期延长，与奎尼丁对心电图的影响颇为相似，而季胺碱具有与乙胺碘呋酮相似的延长Q-T间期、使T波变形、心率减慢和扩张血管及降低血压等作用，在抗乌头碱诱发大鼠心律失常治疗作用的实验中，延胡索总碱中水不溶性(相当于叔胺碱)部分作用更为显著，表明叔胺碱和季胺碱在快速性心律失常方面具有不同的作用机制和作用特点,随后的研究发现延胡索碱的一些主要单体化合物可以抑制钾离子通道和钙离子通道，延长动作电位时程和有效不应期，降低自律性等作用[5]。本研究从动作电位和离子通道角度探讨叔胺碱和季胺碱的抗心律失常方面不同的作用机制和作用特点，结果发现高浓度的叔胺碱和季胺碱均可以延长豚鼠心室肌细胞的动作电位时程(APD)，这可能是2种生物碱皆可延长心电图Q-T间期的原因，但是在低浓度2种生物碱的作用相反，叔胺碱对APD无明显影响，而季胺碱可明显缩短APD，季胺碱的效应双相性可能是其治疗快速型心律失常方面弱于叔胺碱的原因。

目前认为心肌细胞动作电位形成与维持是心肌细胞的特异性或非特异性离子通道在动作电位各期呈现不同开闭的结果，心脏快速延迟整流钾电流(IKr)是心肌细胞动作电位3期复极的主要电流，对IKr通道的抑制是其延长动作电位时程的机制之一，但是天然表达的IKr电流幅值较小，易受其他通道电流的干扰。HERG基因编码IKr的α亚单位，通过利用转染并稳定表达HERG通道的人胚肾细胞株(HEK-293)建立的外源性表达系统可以有效解决这些问题[11-13]。本研究采用这种稳定转染的细胞观察了叔胺碱和季胺碱对HERG通道的影响，结果显示高浓度的叔胺碱和季胺碱均可以抑制HERG通道电流，低浓度的叔胺碱可轻度抑制HERG通道电流，而低浓度的季胺碱与之相反，兴奋HERG通道电流，也呈现明显的双相性。叔胺碱和季胺碱对HERG通道的影响与对心肌细胞动作电位的作用相一致，表明这2种生物碱对动作电位的作用主要是通过抑制IKr产生的，也进一步说明延胡索碱的抗快速心律失常的靶点之一可能是IKr的α亚单位。一些文献报道了延胡索碱的一些单体化合物也对心肌细胞的L-型钙通道具有抑制效应[14]，说明延胡索碱的抗快速心律失常也许是多种特异性或者非特异离子通道共同作用的结果，后续的研究将进一步观察其他类型离子通道的作用。另一方面，阻断IKr电流可导致心电图QT间期延长、T波和U波异常等，易发生室性心律失常，尤其是尖端扭转型室性心动过速(TdP)，可致猝死，体外IKr/HERG通道检测目前已成为心血管安全性药理试验的重要部分,近年中药注射剂频发不良反应事件，中药注射剂对QT间期的影响缺乏风险评估[15]。由于通过口服等方式摄入体内的延胡索碱含量较低，所以心脏毒性并不明显，若制成延胡索碱注射剂时，叔胺碱的对HERG电流抑制的IC50已经达到55 mg/L，有必要对其心脏毒性进行进一步研究。

总之，本研究发现了心脏快速延迟整流钾电流是延胡索碱的抗心律失常机制主要靶点之一，并且延胡索碱的2种生物碱叔胺碱和季胺碱对这种离子通道的作用存在差异。

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