女贞子酒制工艺响应曲面法的优化

刘艳红 杨欣澜

(陕西国际商贸学院，咸阳，712046)

女贞子系木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit的干燥成熟果实，始载于《神农本草经》，列为上品。其性味甘、苦、凉，归肝、肾经。具有滋肾补肝，明目乌发的功能。常用于治疗眩晕耳鸣，腰膝酸软，须发早白，目暗不明等症[1]，现代研究表明，女贞子提取物具有降血糖、抗氧化作用，其提取物对糖尿病大鼠肝损伤具有一定保护作用[2-4]，以上发现将为扩大女贞子的临床应用提供一定的依据。

女贞子的炮制方法始见于宋代·《疮疡》一书，随着历史的发展，炮制方法不断增加，沿用至今。现在女贞子的炮制方法，除了净制、蒸制、酒制、盐制外，还有醋制，全国各地的炮制规范中收载的大多是酒制[5]。1963和1977年版《中华人民共和国药典》均收载为酒炖法，1985—2015年版《中华人民共和国药典》收载为酒炖法或酒蒸法，用酒量为每100 kg女贞子用酒20 kg[6]。

查阅文献及各地炮制规范，发现关于女贞子的炮制的方法及工艺各地各法，闷润时间、蒸制时间的工艺参数也不完备。目前，女贞子药材主要采用酒制，炮制过程中在药材是否闷润、蒸制时间及蒸制温度上，2015版《中华人民共和国药典》和全国各省市的中药饮片炮制规范，均没有明确规定，即便是有规定，参数也不统一，各地各法[7-11]，如此情况饮片质量必然受到影响，饮片的优劣，直接影响着中医治病的疗效[12]，因此，规范女贞子酒制工艺意义重大。本实验中，选取评价指标为女贞子酒制品中齐墩果酸的含量[13]，采用Box-Behnken优化女贞子酒制工艺，确定最佳的酒制工艺参数，为饮片炮制工艺及药材质量的可控性提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters E2695高效液相色谱仪(Waters科技上海有限公司)，TE124S分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，CP225D电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，FW-100D高速万能粉碎机(天津鑫博得仪器有限责任公司)，KQ-A玻璃仪器气流烘干机(北京中兴伟业仪器有限公司)，KH5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂 齐墩果酸对照品(购于食品药品检定研究院，批号：110709-201206)；氯仿、甲醇、磷酸溶液等其他试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

1.3 分析样品 女贞子(采摘于陕西国际商贸学院，经生药教研室雷国莲教授鉴定为木犀科植物女贞的干燥成熟果实)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.1%H3PO4溶液梯度洗脱(0～5 min 85∶15；5～14.5 min 90∶10；14.5～18 min 91∶9；18～25 min 95∶5)，流速为1 mL/min，测定波长210 nm，柱温25 ℃。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品13.07 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成浓度为0.522 8 mg/ mL对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 精密称取经干燥、粉碎后过60目筛的女贞子粉末0.5 g，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加氯仿25 mL，称重，超声波处理30 min，取出，放冷，再称重，用氯仿补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。

2.4 齐墩果酸标准曲线的绘制 取0.522 8 mg/mL的对照品溶液，分别进样2 μL、4 μL、8 μL、10 μL、16 μL、20 μL，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积(A)对齐墩果酸进样量(μg)进行线性回归，回归方程为y=573 784x+55 174(R2=0.999 5)，表明齐墩果酸在1.05～10.46 μg范围内具有良好的线性关系。标准曲线见图1。

图1 齐墩果酸的标准曲线

2.5 单因素考察 黄酒用量、闷润时间和蒸制时间3个因素对齐墩果酸含量的影响[14-15]。

2.5.1 黄酒用量对齐墩果酸含量的影响 精密称取女贞子25 g，分别加入药材量15%、20%、25%、30%、35%、40%的黄酒，闷润1 h，蒸制3 h，取出，摊于瓷盘中，烘箱中50 ℃烘干，取出，放凉，粉碎，按上述制样和色谱方法测定其中齐墩果酸含量。黄酒用量为15%～25%内时，随着黄酒用量的增加，炮制品中齐墩果酸含量增加，但随着黄酒用量继续增加，炮制品中齐墩果酸含量反而降低，这可能是因为随着黄酒用量的增加，药材会出现伤水，齐墩果酸流失。见图2。

图2 黄酒用量对齐墩果酸含量的影响

2.5.2 闷润时间对齐墩果酸含量的影响 精密称取女贞子25 g，加入药材量25%的黄酒，分别闷润时间1、2、3、4、5 h，蒸制时间3 h，取出，摊于瓷盘中，烘箱中50 ℃烘干，取出，放凉，粉碎，按上述制样和色谱方法测定其中齐墩果酸含量。闷润时间为1～3 h内时，随着闷润时间的延长，炮制品中齐墩果酸含量增加，但随着闷润时间继续增加，炮制品中齐墩果酸含量基本不变，考虑节约时间选择闷润时间为3 h。见图3。

图3 闷润时间对齐墩果酸含量的影响

2.5.3 蒸制时间对齐墩果酸含量的影响 精密称取女贞子25 g，加入药材量25%的黄酒，闷润时间3 h，蒸制时间1、3、5、7、9 h，取出，摊于瓷盘中，烘箱中50 ℃烘干，取出，放凉，粉碎，按上述制样和色谱方法测定其中齐墩果酸含量。蒸制时间为1～5 h内时，随着蒸制时间的延长，炮制品中齐墩果酸含量增加，说明蒸制过程有利于齐墩果酸的溶出，但随着蒸制时间继续增加，炮制品中齐墩果酸含量基本不变或略有下降，可能随着蒸制时间延长有些成分分解。见图4。

2.6 响应曲面优化

2.6.1 响应曲面优选分析 在单因素的实验的基础上，根据Box-Behnken的设计原理，选择黄酒用量、闷润时间以及蒸制时间为实验的影响因素，以齐墩果酸含量为响应值，采用三因素三水平进行实验结果分析。在单因素实验的基础上，根据因素水平表1，按照响应曲面Box-Behnken的设计原理，共有17组实验，其实验结果如下表2～3。

图4 蒸制时间对齐墩果酸含量的影响

编号黄酒用量(%)闷润时间(h)蒸制时间(h)1304702535-12023

表2 实验设计及实验结果

通过Design-Expert8.0.6软件对所得数据进行多元回归拟合，得到齐墩果酸含量(Y)对女贞子炮制中黄酒用量(X1)，闷润时间(X2)，蒸制时间(X3)的二次多元回归方程是：Y=1.65+0.044X1+0.024X2+0.039X3-0.16X1X2-0.16X1X3-0.021X2X3-0.28X12-0.13X22-0.19X32。

回归方程的R2=0.985 1，表明实验值与预测值有很好的拟合度。且失拟项不显著，表明方程的模拟好，可以采用这种方法对女贞子的酒制工艺进行预测和分析。从回归方程显著性检查结果显示：回归方程的一次项中，黄酒用量(X1)、蒸制时间(X3)对齐墩果酸含量的影响显著，而闷润时间的一次项不显著；在交互项中，黄酒用量和闷润时间(X1X2)、黄酒用量和蒸制时间(X1X3)的交互项具有非常显著影响，其他无显著性；二次项中，黄酒用量(X12)、闷润时间(X22)、蒸制时间(X32)均具有非常显著性。在各个因素的水平中，对齐墩果酸含量影响结果由大到小的顺序为黄酒用量(X1)>蒸制时间(X3)>闷润时间(X2)。见表3。

表3 方差分析表

2.6.2 响应曲面图谱与分析 根据模型方程绘制的响应曲面图与等高线图见图5～7。从图5～7可以直观地看出三因素的最佳参数及各因素之间的交互作用。图5表示黄酒用量以及闷润时间及其交互作用对齐墩果酸含量的影响，从图中可见，黄酒用量曲面较陡峭，说明黄酒用量对齐墩果酸含量的影响较显著，闷润时间的曲面较平缓，说明闷润时间对齐墩果酸含量的影响不明显[16]。等高线图为椭圆形，说明黄酒用量和闷润时间的交互项对齐墩果酸含量影响显著。黄酒用量和蒸制时间对齐墩果酸含量的影响见图6，黄酒用量和蒸制时间曲面均较陡峭，说明黄酒用量和蒸制时间对齐墩果酸含量的影响较显著，等高线图为椭圆形，说明黄酒用量和蒸制时间的交互项对齐墩果酸含量影响显著。图7为闷润时间与蒸制时间对齐墩果酸含量的响应曲面图，由图可以看出当黄酒用量一定时，齐墩果酸含量都是随着闷润时间与蒸制时间的增加呈现先增加后降低的趋势，闷润时间与蒸制时间的坡面都较陡，则说明它们的二次项对齐墩果酸含量的影响都比较显著。等高线趋于椭圆，但不明显，说明闷润时间与蒸制时间的交互项对齐墩果酸含量的影响不显著。

根据实验设计所得出的结果以及二次回归模型的数学分析结果，使用Design-Expert 8.0.6软件计算可得到女贞子酒制工艺的炮制条件为黄酒用量25.19%，闷润时间3.06 h，蒸制时间5.16 h，齐墩果酸含量的理论值为1.650 35%。

为了验证响应曲面法所得结果以及其可实施性，通过实验对优化后炮制工艺条件进行确定。对最佳提取工艺的参数而进行调整，达到方便操作的要求，最终工艺条件调整为黄酒用量25%，闷润时间3.1 h，蒸制时间5.2 h。在此条件做3次平行实验，得到齐墩果酸的平均含量为1.64%。本实验研究为进一步有效、合理的对女贞子药材进行酒制提供参考依据，将在一定程度上保证女贞子炮制品品质的稳定性。

图5 黄酒用量与闷润时间的响应曲面图和等高线图

图6 黄酒用量与蒸制时间的响应曲面图和等高线图

图7 闷润时间与蒸制时间的响应曲面图和等高线图

2.7 结果分析 本实验通过响应曲面法考察了黄酒用量、闷润时间、蒸制时间对女贞子炮制品中齐墩果酸含量的影响。二次方程的模型回归差异极显著，且二次方差分析后的失拟项检验不显著，说明本实验所建立的二次回归方程正确反映了所考察因素与响应值之间的关系，试验设计科学合理；利用回归模型对影响齐墩果酸含量的关键因素及其相互作用进行了探讨；通过工艺条件的优化得到女贞子的酒制最佳炮制工艺条件为黄酒用量25.19%，闷润时间3.06 h，蒸制时间5.16 h，在此条件下，齐墩果酸含量的理论值为1.650 35%。为了方便操作，对最佳提取工艺的参数进行调整，最终工艺条件调整为黄酒用量25%，闷润时间3.1 h，蒸制时间5.2 h。在此条件做3次平行实验，得到齐墩果酸的平均含量为1.64%，相对误差为0.63%，与预测值接近。

3 讨论

本实验在建立HPLC法测定女贞子中齐墩果酸的含量测定方法过程中，为了使齐墩果酸和女贞子中其他成分良好分离，探索采用了梯度洗脱的方法，最终使齐墩果酸与其他成分实现了较好的分离。

炮制工艺优化传统上有正交实验和均匀试验等较为常用，传统优化方法虽然试验次数少，但精密性差[17]，不能完全作为大生产的参考。响应曲面法能把因素与响应值的相互关系函数化，建立连续变量曲面模型，对各因素进行了全面的优化研究，比正交试验设计更直观、精确地得到最优组合条件[18-19]。由此得到更优的女贞子炮制工艺条件，为女贞子药材质量和品质的可控性提供保证。因此，该炮制方法可以在女贞子的炮制工艺研究及生产中推广应用。

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