沉默白细胞介素-1β基因对脊髓钝挫伤大鼠波形蛋白的影响①

胡析，牛英杰，黄媛，李盈洁，曾茜，向阳，张晓，梁楠

1.成都医学院，a.临床医学院；b.检验医学院；c.基础医学院实验教学中心，四川成都市610500

脊髓损伤是中枢神经系统常见的外伤，常由于车辆事故、高空坠落等造成，给患者、家庭和社会带来巨大的心理压力和沉重的经济负担[1-2]。脊髓初期机械性损伤导致脊髓缺血、缺氧、水肿、炎症、脂质过氧化和自由基损伤等二次损伤，其中炎症反应是导致神经损伤和功能丧失的重要原因[3-4]。

白细胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)是一种重要的炎性因子，可介导中性粒细胞浸润，引起白细胞聚集，刺激白细胞、内皮细胞等表达黏附分子，进而导致过度的炎症反应和脊髓缺血，还能促进自由基和兴奋性氨基酸等神经毒性物质的产生和释放[5-6]。IL-1β在脊髓损伤早期过量表达，参与急性脊髓损伤发生发展过程，加重炎症反应，造成组织损伤，诱导神经细胞的凋亡[7-8]。

波形蛋白(vimentin,Vim)是目前已知表达最广泛的Ⅲ型中间丝蛋白，与微管、微丝一起构成细胞骨架，与中枢神经系统的分化、发育以及损伤修复等生物学行为密切相关[9]。在脊髓损伤早期，炎症反应刺激星形胶质细胞进入增殖状态。星形胶质细胞肿胀、肥大，发生反应性胶质增生，与结缔组织等形成胶质瘢痕[10]。在脊髓损伤早期，IL-1β作为炎症因子不仅加重脊髓缺氧缺血区域的炎症反应，还会导致神经胶质细胞增生。在脊髓损伤晚期，脊髓胶质瘢痕导致运动功能难以恢复[11]。波形蛋白不仅能维持细胞骨架稳定，还与损伤后胶质瘢痕形成和抑制轴突再生有关[12]。

本研究采用免疫组化技术以及实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)，对波形蛋白表达进行定位和定量研究。利用慢病毒干扰IL-1β基因表达，生物信息学方法预测IL-1β与波形蛋白的关系，了解脊髓损伤后干预IL-1β的表达对脊髓胶质瘢痕的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年Sprague-Dawley大鼠30只，3月龄，雌雄不限，体质量200～220 g，由四川省中医药科学院提供，许可证号SCXK(川)2013-19。分笼饲养，温度20～25℃。大鼠编号，采用Excel生成随机数，将大鼠分为空载组(n=15)和干扰组(n=15)，两组再分为3 d、7 d和28 d三个亚组，3 d和28 d亚组各3只大鼠，7 d亚组9只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒质粒的制备

引物和质粒均购自GeneCopoeia。将IL-1βsiRNA序列克隆到红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)标记的载体中，将该载体5μg和慢病毒1μl包装质粒，共转染到293T细胞，生成慢病毒质粒。48 h后取含有慢病毒细胞的上清液，置于0.45μm醋酸纤维素过滤器中过滤，除去滤液，取5 ml，4℃、3500 r/min离心25 min，除去上清液，沉淀重新溶解在PBS 500 μl中。-80℃冰箱冻存。

1.2.2 载体注射

大鼠用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉，雄性30 mg/kg，雌性20 mg/kg。俯卧位固定，常规备皮、消毒，背部T9-11水平正中切口，分离筋膜、肌肉，剥除T11棘突及椎板，充分暴露T10节段脊髓。使用DW-5脑立体定位仪(成都泰盟)于T10节段脊髓拟打击点左右两侧各注射慢病毒质粒5μl(干扰组)或含有空载体的质粒5μl(空载组)，进针3～5μm，朝着大鼠尾侧进针，与水平线呈45°。依次缝合肌肉、筋膜及皮肤，消毒及抗感染处理后独笼饲养。

1.3 模型制备

大鼠在注射质粒48 h后，同法麻醉，常规消毒，拆线打开切口，采用Allen法以自行制作的打击装置，用10 g冲击棒自30 mm高处自由坠落，致伤脊髓。逐层缝合伤口。

术后大鼠注射青霉素16万U、5%葡萄糖氯化钠溶液2 ml，小心护理，独笼饲养。每天早晚挤压大鼠膀胱协助排尿各2次，至排尿反射恢复。注意观察皮肤有无压疮或感染、下肢有无溃烂。室温维持25～30℃，正常饮食。

大鼠的模型操作和术后护理遵循《关于善待实验动物的指导性意见》、《实验动物管理条例》、《医学实验动物管理实施细则》的规定。

1.4 免疫组化染色

各组术后3 d、7 d及28 d各取3只大鼠，同法麻醉，俯卧位固定，自左心室插管，剪开右心耳，快速灌注4℃生理盐水，至肝脏变为黄褐色，再灌注4%多聚甲醛20 min。打开椎弓管，暴露并切除T8、T10、T12脊髓，固定48 h后放入自动脱水包埋机，常规制备石蜡切片，厚5μm，取连续5张贴片、烤片。

酶免疫组化染色采用SP法。烤片、脱蜡及水化，高压热抗原修复，3%H2O2封闭内源性过氧化酶，正常山羊血清封闭非特异性抗原。加波形蛋白一抗(1∶200，武汉博士德)4℃过夜；次日取出复温，0.01 mol/L PBS漂洗，依次加入SP试剂(SP-9001，北京中杉金桥)B液与C液，37℃孵育，间隔使用PBS漂洗；配制DAB-H2O2显色液，室温下反应。显微镜下显色充分，及时用0.01 mol/L PBS终止反应。苏木素复染，1%盐酸-酒精分色，自来水返蓝，梯度洒精逐级脱水，二甲苯透明，树胶封片。OLYMPUS光学显微镜400倍下观察免疫阳性反应物分布情况。

1.5 RT-qPCR

术后7 d大鼠6只同法麻醉，以损伤段为中心，取出损伤段脊髓1 cm，-80℃冰箱保存。脊髓放入经过DEPC水处理过后的玻璃匀浆器中，经Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇处理，得到总RNA，去核酸水30μl溶解，保存于-80℃冰箱。取所得RNA经全波长酶标仪(Thermo,1510)测量OD值，检测其纯度合格后，按说明书进行逆转录合成cDNA(Revert AidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit，MBI公司)，然后进行引物扩增。扩增参数：95℃2 min，95℃15 s，52℃20 s，60 ℃ 40 s， 45个循环。读取Ct，按2-ΔΔCt计算出相对含量。

引物如下：

IL-1β：正向 5'-GAG CTG AAA GCT CTC CAC C-3'；逆向 5'-TTCCATCTTCTTCTTTGGGT-3'。

波形蛋白：正向5'-CTC TGC CAC TCT TGC TCC TGG A-3'；逆向5'-AAA TAT CTG ACC AAC TTGTTA C-3'。

β-actin：正向 5'-GAA GAT CAA GAT CAT TGC T-3'；逆向 5'-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3'。

1.6 生物信息学分析

通过http://www.genemania.org/进行搜索。物种选择H.sapiens(human)和R.norvegicus(rat)，目的基因选择IL-1β和波形蛋白。

1.7 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件处理数据。数据以(xˉ±s)表示，采用独立样本t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 生物信息学分析

2.1.1 人类基因

IL-1β与肌联蛋白(Titin,TTN)存在共同表达关系，与IL-1受体1(IL1R1)位于同一信号通路，拥有相同的物理反应结构域。波形蛋白与IL1R1共表达，与TTN存在共同表达，并位于同一信号通路中。见图1。

2.1.2 大鼠基因

波形蛋白与IL-18、CXC类趋化因子10(C-X-C motif chemokine ligand 10,CXCL10)、S100钙结合蛋白A8(S100 calcium binding protein A8,S100A8)、S100A9、受体相互作用蛋白激酶-3(receptor interacting serine/threonine kinase 3,RIPK3)、趋化因子C-C配体3(C-C motif chemokine ligand 3,CCL3)存在共同表达关系。波形蛋白与CXCL2和磷脂酶A2-ⅣA(Phospholipase A2 Group IVA,PLA2G4A)存在共同表达和共同的物理反应结构域的关系。IL-1β与S100A8、S100A9、CCL3、CXCL2、PLA2G4A、CXCL1、细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)存在共同表达。IL-1β与IL18存在共同表达和共享蛋白结构域，与CXCL10和RIPK3存在共同表达和共同定位。见图2。

2.2 免疫组化染色

波形蛋白存在于脊髓前角神经元和神经胶质细胞中。各时间点，干扰组免疫阳性细胞数均低于空载组(P＜0.05)。见表1、图3。

图1 人类基因中IL-1β与波形蛋白的预测关系

图2 大鼠基因中IL-1β与波形蛋白的预测关系

表1 各时间点各组脊髓中波形蛋白阳性细胞数比较(/HD)

图3 各时间点各组脊髓中波形蛋白表达(免疫组化染色，400×)

2.3 RT-qPCR

术后7 d，干扰组波形蛋白mRNA相对表达量(0.279±0.023)，较空载组(0.818±0.178)明显下降(t=6.692,P=0.002)。

3 讨论

脊髓损伤是一个破坏性严重且病理生理比较复杂的临床疾病，能够造成神经再生与功能恢复障碍，可导致运动、感觉和自主神经功能障碍。

本研究显示，脊髓损伤后，大鼠神经功能改善有限，不足以引起运动功能有意义的改变；波形蛋白主要在脊髓前角神经元和神经胶质细胞中表达；抑制IL-1β表达后，波形蛋白表达明显下降。

脊髓损伤的功能恢复与神经胶质细胞的功能密切相关。在中枢神经系统，神经胶质细胞分布广泛，具有支架作用，支持神经元胞体和突起保持一定形态。神经胶质细胞在出生后仍然保持一定的分裂能力[13]。

脊髓损伤后限制神经再生的主要原因有胶质瘢痕形成、抑制性微环境(硫酸软骨素蛋白聚糖和髓磷脂相关抑制因素)和神经营养支持的缺乏。其中胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、波形蛋白和巢蛋白等中间丝蛋白的沉积是主要因素，星形胶质细胞肥大为特征的反应性神经胶质增生[14]。

脊髓损伤后，星形胶质细胞活化与神经炎症反应密切相关。在炎症因子等环境条件因子的作用下，静止的星形胶质细胞被激活，细胞体积肥大、数量增加，细胞间互相连接形成致密网状结构，过度表达中间丝蛋白，如GFAP和波形蛋白[15-16]。

波形蛋白是哺乳动物中间丝蛋白的一种，表达于间充质细胞、软骨细胞和内皮细胞，在反应型星形胶质细胞表达上调[17-18]。波形蛋白在形成胶质瘢痕并抑制轴突再生的过程中发挥重要作用[19-20]。

IL-1β是重要的炎症因子，在脊髓损伤后早期大量释放，造成脊髓二次损伤[21]。IL-1β主要来源于脊髓损伤局部的神经元和神经胶质细胞。在正常中枢神经系统中几乎检测不到IL-1β表达，但损伤后表达增加数倍[22]。宋兴华等[23]研究发现，IL-1β在脊髓损伤后30 min表达快速增高，并于损伤后6 h达到高峰，此后逐渐下降。IL-1β参与合成损伤介质，促进机体炎症反应，导致脊髓损伤局部炎症和水肿[24]，引起脊髓组织溃变和坏死，进而形成脊髓空洞。此外，IL-1β还可能参与细胞凋亡过程[25]。Nesic等[26]研究表明，IL-1β受体拮抗剂可明显减少脊髓损伤区细胞凋亡。

脊髓损伤后IL-1β对波形蛋白表达可能有影响。GeneMANIA生物信息学分析显示，IL-1β与波形蛋白存在着多种直接或间接关系。IL-1β是一种重要的炎性介质，在正常脊髓组织中，IL-1βmRNA表达微弱，而在脊髓损伤后3 h表达迅速升高，并于12 h达到峰值；随后表达逐渐降低[27]。脊髓损伤后，IL-1β可能参与诱导神经胶质细胞增生，促进波形蛋白表达和胶质瘢痕形成；抑制波形蛋白表达可减少瘢痕的形成，促进损伤部位轴突的延伸。

综上所述，波形蛋白广泛表达于神经胶质细胞，促进损伤后胶质瘢痕形成。通过调节炎症因子IL-1β可以影响胶质细胞的增殖和脊髓瘢痕形成，进一步影响脊髓损伤后大鼠功能恢复，为将来临床治疗脊髓损伤提供了可能的治疗新靶点。

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