肿瘤抑制基因PAQR3在肺癌中表达水平降低

燕 杰，蒋 琪

(天津医学高等专科学校， 天津 300222)

在全球范围内，肺癌是发病率和病死率增长最快、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，肺癌分别占男性和女性癌症的17%和9%[1]，造成了约19%的癌相关死亡。深入了解肺癌的发生发展机制，寻找新的治疗靶点，对于肺癌的早期发现和诊断以及提高治疗效果有着非常重要的意义。有报道，孕激素和脂联素分子受体3(progestin and adipoQ receptor 3，PAQR3)在前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌和胃癌等多种肿瘤中表达降低[2- 3]，而且在肿瘤形成、生长和转移等过程中发挥了抑制作用。但是，关于PAQR3在肺癌中的相关研究还比较少。因此，本文对肺癌组织中PAQR3的表达情况进行了检测和分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例:选取40例不同年龄、不同性别已经接受过外科手术，但未接受过任何放疗和化疗的肺癌患者的肺癌组织和癌旁组织石蜡标本，收集标本时间为2015-2016年，其中男26例，女14例；年龄42～78岁，平均年龄55.6岁。

1.1.2 试剂:PAQR3和β-actin引物(上海生工生物工程股份有限公司)，总RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific公司)，UltraSYBR Mixture(北京康为世纪生物科技有限公司)，PAQR3抗体(Abcam公司)，β-actin抗体和二抗(博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Real-time RT-PCR检测PAQR3 mRNA表达:取50 mg组织，在研钵中研磨，研磨期间不断加入液氮，随后提取总RNA，NanoDrop2000测定RNA浓度及A260/A280比值(1.8～2.0)后进行反转录。设计real-time RT-PCR引物，并通过NCBI blast检测其特异性。PAQR3引物：5′-AACCCGTACAT CACCGACG-3′(F)，5′-TCTGGACGCACTTGCTGAAG-3′(R)；β-肌动蛋白(β-Actin)引物：5′-CATGTACGTTGCTATC CAGGC-3′(F)，5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′(R)。反应体系50 μL：2×UltraSYBR Mixture 25 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，双蒸水21 μL。反应条件：95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。

1.2.2 Western blot检测PAQR3蛋白表达:取50 mg组织，匀浆后提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，4 ℃孵育一抗过夜，洗去一抗以辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育2 h，洗涤后使用Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统曝光成像，分析结果，β-actin作为内参。

1.3 数据统计:采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。实验结果用均数±标准差表示。配对的肺癌和癌旁组织样本的实验结果以及GSE18842芯片数据通过配对样本的t检验进行分析。

2 结果

2.1 肺癌组织中PAQR3 mRNA的表达情况:40例样本中有36例(90%)肺癌组织中PAQR3 mRNA的表达水平降低，明显低于对照组(8.53±0.96 vs 10.28±1.61)(P<0.001)。

2.2 肺癌组织中PAQR3蛋白的表达情况:与癌旁组织相比，肺癌组织中PAQR3蛋白的表达水平降低(P<0.01)(图1)。

2.3 GEO数据分析:在NCBI GEO数据库芯片GSE18842中包含44个配对的非小细胞肺癌与癌旁组织，在癌组织中PAQR3基因mRNA的表达水平显著低于癌旁组织(3.39±0.13 vs 3.47±0.17)(P<0.05)。

3 讨论

PAQR3是孕酮和脂联素受体(PAQR)家族中的一员，人PAQR3基因定位于染色体4q21.21，其编码的蛋白分子质量大小约37 ku。PAQR3被报道可以将细胞质中的Raf- 1锚定至高尔基体， 阻断EGF刺激的Raf- 1膜转位， 降低Raf- 1与Ras和MEK1的相互作用，对Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的活化起到了阻断的作用，从而抑制肝癌的生长。

N.cancer ajacent tissues; T.cancer tissues; *P<0.01 compared with cancer ajacent tissues图1 PAQR3在肺癌组织及癌旁组织中的蛋白表达水平Fig 1 The expression level of PAQR3 protein in lung cancer tissues and adjacent normal tissues(±s, n=3)

本研究发现，PAQR3在肺癌组织中的mRNA和蛋白表达水平均明显低于癌旁组织，PAQR3的低表达可能在肺癌的发生发展过程中发挥了一定的作用。研究报道[4]，DNA损伤结合蛋白2(damage-specific DNA-binding protein 2，DDB2)可能参与了PAQR3的泛素化和降解，这可能是PAQR3表达降低的机制之一。

总之，PAQR3在肺癌组织中呈明显低表达，但其表达水平降低和发挥作用的具体机制还有待于进一步研究，来为阐明肺癌的发生发展规律提供帮助，为肺癌的诊断和治疗提供新的思路。

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL,etal. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65: 87- 108.

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[3] Li RH, Zhang AM, Li S,etal. PAQR3 gene expression and its methylation level in colorectal cancer tissues[J]. Oncol Lett,2016,12: 1773- 1778.

[4] Guo W, You X, Xu D,etal. PAQR3 enhances Twist1 degradation to suppress epithelial-mesenchymal transition and metastasis of gastric cancer cells[J]. Carcinogenesis,2016,37: 397- 407.