小鼠颌下腺上皮细胞的体外培养及鉴定

张晓娟，段梦园，李 娟，郭 磊，鞠 瑞，朱 蕾，叶菜英

(中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 药理系， 北京 100005)

唾液腺是人体重要的腺体之一，包括腮腺、颌下腺和舌下腺3对大唾液腺以及散在分布口腔各壁的众多小唾液腺，其主要功能是分泌唾液，参与咀嚼、吞咽、消化、发音和言语等[1]。唾液腺功能减退可导致相关疾病，典型代表是干燥综合征(Sjögren’s syndrome, SS)，该病由于唾液腺受累导致口腔干燥[2]。鉴于唾液腺是SS中的重要受损靶器官，建立唾液腺细胞体外培养方法对于研究其功能，进一步探讨SS的发病机制以及评价SS的治疗药物具有重要意义。

本研究采用胶原酶消化法培养小鼠颌下腺上皮细胞，探究颌下腺上皮细胞分离、培养的最佳方法和条件，为进一步的实验研究提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 动物与材料

SPF级C57BL/6小鼠，4周龄左右，体质量17～22 g，雌雄不拘[北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014- 0004]；IV型胶原酶(Sigma公司)；DMEM高糖培养基、F- 12培养基(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；胎牛血清(Gibco公司)；表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)(R&D公司)；细胞角蛋白8(cytokeratin 8, CK- 8)抗体、波形蛋白(vimentin)抗体和山羊抗兔IgG/Alexa Fluor 488标记(Abcam公司)；锥虫蓝染液(碧云天生物技术有限公司)；CCK- 8试剂盒(日本东仁化学科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 颌下腺上皮细胞的分离与培养[3- 6]：断颈处死小鼠，75%乙醇浸泡消毒后，超净台内无菌摘取双侧颌下腺，冰PBS漂洗，去除附带的脂肪、包膜等，剪碎，加入Ⅳ型胶原酶(0.25 g/L，PBS配置)，37 ℃消化3 h，期间每隔30 min轻轻振荡以促进消化。消化后的液体经100目筛网过滤后，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加红细胞裂解液5 mL，轻轻吹打充分裂解红细胞后，PBS清洗，用少量培养基(F- 12∶DMEM=3∶1，2.5% FBS，10 μg/L EGF，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素)重悬细胞，调整浓度后接种于大培养皿中，37 ℃、5% CO2培养。每隔2～3 d换1次培养基，细胞铺满单层后进行传代培养。

1.2.2 细胞形态学的观察：从培养的第1天开始，每隔1 d光学显微镜下观察细胞形态，记录细胞增殖状态并拍照。

1.2.3 颌下腺细胞的纯化[7]：最初分离的细胞中混有成纤维细胞，根据成纤维细胞与目的细胞贴壁能力和时间的差别，采用差速贴壁法去除成纤维细胞。成纤维细胞的贴壁能力强，在接种30～60 min左右基本完全贴壁，目的细胞约24 h贴壁。接种细胞约1 h后，将含有目的细胞的上清收集继续培养，反复多次即得到纯度较高的目的细胞。

1.2.4 细胞存活率的测定：接种前采用锥虫蓝染色法测定细胞存活率。取适量细胞悬液与锥虫蓝染液混匀，滴入细胞计数板。3 min内，在显微镜下计数300个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算公式：存活率(%)=(活细胞数/300)×100%。

1.2.5 免疫荧光染色鉴定细胞：取对数期细胞，爬片后4%多聚甲醛固定20 min，0.3% Triton X- 100通透，牛血清白蛋白封闭后，一抗(CK- 8 抗体或vimentin抗体)4 ℃孵育过夜。PBS清洗后，山羊抗兔IgG/ Alexa Fluor 488标记的二抗37 ℃孵育1 h，避光操作，最后DAPI染核，封片，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.6 细胞增殖曲线检测[7- 8]：细胞消化计数后，调整细胞浓度至5×106个/L，接种至10块96孔板，每孔200 μL细胞悬液，接种24 h后每天用CCK- 8法检测，具体为：每孔加入20 μL CCK- 8试剂，孵育4 h后450 nm处测定吸光度值。以时间为横轴，吸光度值为纵轴，绘制细胞增殖曲线。

2 结果

2.1 细胞存活率

接种前用锥虫蓝染色法测定细胞存活率，大约为97.5%。

2.2 颌下腺细胞的形态学特征

体外培养的原代细胞24 h左右贴壁，此时细胞为圆形，之后细胞慢慢伸展，呈现多边形。第2天细胞开始形成集落，增殖的细胞呈形态一致的立方体，第7～8天见部分细胞表现为铺路石样排列，未见导管或腺泡样结构(图1)。传代细胞与原代形态基本一致，接种后7～9 d可进行传代培养，一般能传3代，至第4代细胞活性变差，死亡的细胞变多，镜下观察发现培养基中漂浮大量细胞碎片，且细胞形态转变为星形，表面出现突起，已不适合做进一步实验研究。

图1 原代培养的颌下腺细胞Fig 1 Primary culture of the submandibular gland cells (×100)

2.3 免疫荧光染色结果

体外培养的颌下腺细胞CK 8表达阳性，胞质呈现绿色荧光(图2A)，细胞核呈蓝色荧光，阳性率约为85%；vimentin表达为阴性(图2B)，提示培养的细胞为颌下腺上皮细胞。

A.culture cells were positively stained by CK 8 antibody; B.culture cells were negatively stained by vimentin antibody图2 免疫荧光染色法鉴定颌下腺细胞Fig 2 Identification of the submandibular gland cells by immunofluorescence staining (×200)

2.4 细胞增殖特点

根据吸光度值绘制细胞增殖曲线。细胞于第1～2天处于滞留期，完成贴壁并有部分增殖，第3天开始进入对数期，细胞增殖迅速，第7天达到顶峰，随后细胞增殖趋势缓慢下降(图3)。

图3 颌下腺上皮细胞的增殖曲线Fig 3 Proliferation curve of the submandibular gland

3 讨论

SS是一种常见的慢性炎症性的自身免疫性疾病，发病率逐年增高[2]。唾液腺破坏是其重要表现，80%患者有口腔干燥症，唾液分泌明显减少，严重者影响说话，甚至出现“猖獗齿”[9]。目前SS的发病机制尚未阐明，现有治疗方法非常有限，且收效甚微。因此建立体外细胞培养模型，有助于为SS以及其他唾液腺相关疾病的研究和药物评价提供体外实验模型。

唾液腺细胞是一种终末分化细胞，培养相对困难，一直是众多学者研究的难题。目前唾液腺细胞培养大多取材于大鼠腮腺，或者在培养液中添加糖皮质激素、胰岛素等以促进细胞增殖[7, 10- 11]。然而，唾液的70%由颌下腺分泌，且有研究报道SS患者的颌下腺功能损害较腮腺常见，SS患者早期颌下腺唾液流量减少亦比腮腺更显著[12]。而且，SS作为一种自身免疫性疾病，培养液中添加糖皮质激素等药物不利于细胞保持原有的功能，干扰对SS发病机制的探讨以及治疗药物的评价。

目前已知颌下腺上皮细胞的培养方法包括组织块法和胶原酶消化法，与前者相比，胶原酶消化法能缩短获取大量细胞的时间[11]。本研究采用作用温和的Ⅳ型胶原酶消化细胞以减轻对细胞的损伤，锥虫蓝染色法显示细胞存活率达97.5%。随后采用差速贴壁法除去混杂的成纤维细胞，获得较为纯化的目的细胞。颌下腺细胞是一种需复杂营养的、在一般合成培养基中不易增殖的细胞，我们用含10 μg/L EGF的F- 12/DMEM培养液进行培养获得成功，简化了实验，且颌下腺是产生EGF的主要器官，体外培养的颌下腺上皮细胞本身可合成并分泌EGF[13]，因此添加低浓度的EGF有利于细胞增殖并保持功能，且不会影响后续实验研究。经过上述方法得到的原代和传代培养细胞，形态呈上皮样，镜下观察为多边形，铺路石样排列。根据增殖曲线，细胞增殖能力良好，一般能传3代，到第4代时，增殖能力明显降低。在细胞鉴定方面，CK- 8表达阳性，而vimentin表达阴性，符合唾液腺细胞的表型特征，证实了所培养的细胞为上皮来源的可靠性。

综上所述，本研究采用胶原酶消化法获得了增殖良好的小鼠颌下腺上皮细胞，方法简便易行，这为进一步研究提供了良好的实验模型。

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