姜黄素抑制顺铂诱导人肾小管上皮细胞系HK- 2凋亡

吕文秀，吴文韬，郑士梅，谢林虎，丁伯平*

(1.皖南医学院 临床医学院；2. 皖南医学院 基础医学院 药理学教研室，安徽 芜湖 241000)

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恶性肿瘤已经成为当今人类面临的巨大难题，2013年中国恶性肿瘤发病率为235/10万[1]。目前恶性肿瘤尚无有效的治愈方法，只能通过各种治疗手段来抑制或减缓癌细胞的增殖。顺铂(cisplatin, DDP)是一种临床常用的抗癌药物，用于肝癌等多种实体肿瘤的治疗[2]。但是作为治疗恶性肿瘤的基础药物，顺铂在抗癌的同时具有较强的细胞毒性[3]， 其中最严重的就是肾毒性[4]， 严重影响了治疗效果，限制了该药的应用与推广。姜黄素(curcumin,CUR)是一种从姜黄根茎中提取得到的具有抑制肿瘤生长、抗动脉硬化与抗感染等多种作用的化合物[5]。目前研究表明凋亡蛋白的激活及表达增加在细胞凋亡中具有介导作用[6]。联系抗癌药物顺铂在治疗过程中的肾毒性，顺铂与姜黄素均有抗肿瘤作用，同时姜黄素对肾毒性有一定的抑制作用[7]，而姜黄素对顺铂诱导的HK- 2细胞凋亡是否具有抑制作用的相关机制不明。基于此课题通过对HK- 2细胞培养并加入顺铂和姜黄素进行实验，通过检测细胞中凋亡蛋白的表达探讨姜黄素是否对顺铂诱导产生的肾毒性具有抑制作用，将有助于缓解恶性肿瘤患者肾功能损伤，以提高治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料

人肾小管上皮细胞系GF069 HK- 2(上海歌凡生物科技有限公司)；顺铂注射液P4394和姜黄素C7727(Sigma公司)；RPMI 1640(不含双抗) PYG0050(武汉博士德生物工程有限公司)；RPMI 1640(含双抗)CM0001(浙江天杭生物科技股份有限公司)；MTT溶液ST316、二甲基亚砜(DMSO)ST038、胰蛋白酶细胞消化液C0201、PBS缓冲液C0221A、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) A0208、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L) A0216、Bax抗体AB026、Bcl- 2抗体AB112、RIPA裂解液P0013C、BCA蛋白浓度测定试剂盒P0012S和SDS-PAGE凝胶配置试剂盒 P0012A(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组：将HK- 2细胞接种于200 μL培养瓶中，培养基为RPMI 1640(含双抗)，置入37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，待细胞达70%～80%汇合度时，用胰蛋白酶进行定期消化和传代。细胞分组为对照组、单纯姜黄素组(10 μmol/L姜黄素)、顺铂模型组(顺铂)、低剂量姜黄素保护组(10 μmol/L姜黄素+顺铂)、高剂量姜黄素保护组(20 μmol/L姜黄素+顺铂)，顺铂浓度取IC50值。

1.2.2 MTT实验检测细胞增殖：取对照组细胞，用胰蛋白酶消化，调整制成细胞数为5×107个/L的细胞悬液，接种于96孔板，每孔加入100 μL。将96孔板置入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后，弃上清，分别加入不同浓度顺铂的10%胎牛血清培养基100 μL，使其浓度为2、4、8、16、32、64、128、256、512和1 024 μmol/L。每个浓度设置3个复孔，将96孔板置于培养箱中培养24后，每孔分别加入MTT溶液20 μL，避光，培养4 h后,弃上清,加入100 μL DMSO，避光振荡摇匀培养板10 min，用酶标仪测取吸光度值，波长设置490 nm处，测量96孔板中各孔吸光度值(A)。重复实验，取细胞的清除率为50%时对应的顺铂浓度为顺铂IC50。取1.2.1分组细胞接种于96孔板中，检测细胞增值率。细胞存活率=(实验组A-空白组A)/(对照组A-空白组A)。

1.2.3 Western blot检测：取1.2.1分组细胞接种于培养皿中。将培养皿置于培养箱中培养24 h后，将细胞置于冰上，弃除细胞培养基，PBS预冷后洗涤两次，加入细胞裂解液，冰上放置30 min，1.5 mL EP管中收集枪头刮下的细胞， 4 ℃离心25 min，收集上清，蛋白定量后存放于-30 ℃保存。取40～60 μg蛋白进行聚丙酰胺凝胶电泳，300 mA、120 min转膜。一抗为兔抗Bax多克隆抗体、兔抗Bcl- 2多克隆抗体，二抗为羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG。采用电化学发光(ECL)液显影成像。采用GelPr04软件进行吸光度分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 MTT实验结果

2.1.1 不同浓度顺铂对HK- 2细胞凋亡的影响：起初观察到顺铂浓度和HK- 2细胞凋亡率为非线性关系，遂把顺铂浓度C变换为log10C，然后将其与细胞凋亡率做相关分析，两者之间呈正相关，相关系数r=0.991(P<0.05)。log10C为1.31， C为20.41 μmol/L时，细胞凋亡50%，即顺铂IC50为20.41 μmol/L，为方便后续实验，取20.00 μmol/L(图1)。

2.1.2 姜黄素与顺铂单独及联合应用对HK- 2细胞增殖的影响：与对照组相比，顺铂组细胞增殖率降低(P<0.05)；与高剂量姜黄素保护组相比，顺铂组细胞增殖率降低(P<0.05)；顺铂组细胞增殖率低于低剂量姜黄素保护组(P<0.05)；高剂量姜黄素保护组细胞增殖率高于低剂量姜黄素保护组(P<0.05)(图2)。

图1 顺铂浓度与细胞凋亡的关系Fig 1 Relationship of “cisplatin-apoptosis”

*P<0.05 compared with control group(0 μmol/L DDP); △P<0.05 compared with DDP(20 μmol/L) ; #P<0.05 compared with DDP(20 μmol/L) and CUR(10 μmol/L)+DDP(20 μmol/L)图2 不同组别细胞增殖情况Fig 2 Cell survival situation in different groups

2.2 Western blot实验结果

与对照组相比，顺铂组Bax蛋白表达上调(P<0.05)；与顺铂组相比，高剂量姜黄素保护组Bax蛋白表达下调(P<0.05)；与顺铂组相比，低剂量姜黄素保护组Bax蛋白表达下调(P<0.05)；与低剂量姜黄素保护组相比，高剂量姜黄素保护组Bax蛋白表达进一步下调(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with control group(0 μmol/L DDP); △P<0.05 compared with DDP(20 μmol/L) ; #P<0.05 compared with DDP(20 μmol/L) and CUR(10 μmol/L)+DDP(20 μmol/L)图3 不同组别Bax蛋白的表达Fig 3 Bax protein level in different groups

与对照组相比，顺铂组Bcl- 2蛋白表达明显下调(P<0.05)；与顺铂组相比，高剂量姜黄素保护组 Bcl- 2蛋白表达上调(P<0.05)；与顺铂组相比，低剂量姜黄素保护组Bcl- 2蛋白表达上调(P<0.05)；与低剂量姜黄素保护组相比，高剂量姜黄素保护组Bcl- 2蛋白表达进一步上升(P<0.05)(图4)。

3 讨论

顺铂作为广谱抗癌药，临床应用中发现顺铂化疗肾损害发生率高达30%，这严重影响了患者的治疗效果和身体健康。而在药物性肾损伤中，肾小管外层髓质S3段为常见累及部位[8]，S3段细胞上含有机离子转运蛋白2，可进行主动运输摄入顺铂，顺铂在细胞内累积造成顺铂的肾毒性。目前研究证实，姜黄素能够减轻顺铂诱导的肾毒性,其机制可能与其抗氧化和清除自由基活性有关，姜黄素通过MAPK信号通路，抑制ERK1/2 的磷酸化，增加抗氧化酶活性，抑制 ROS的产生，减少高糖引起的氧化应激损伤[9]。

细胞凋亡受凋亡蛋白的调控，凋亡蛋白又可分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白， 其中Bax为促凋亡蛋白，Bcl- 2为抗凋亡蛋白。因此Bax与Bcl- 2的表达在细胞凋亡中占有重要作用。在细胞凋亡的内源性途径中，Bax作为线粒体膜上离子通道重要组成部分，可使细胞色素C进入线粒体，与Apaf- 1形成复合物，从而激活caspase- 9与caspase- 3，促使细胞凋亡的发生[10]。Bcl- 2可通过阻止细胞凋亡早期环节，阻止细胞染色质浓缩及DNA裂解，抑制细胞凋亡。本实验通过Western blot检测显示，姜黄素与顺铂联合作用时Bax蛋白表达呈下降趋势，Bcl- 2蛋白表达呈上升趋势，提示HK- 2细胞凋亡降低。证实了在姜黄素作用下，顺铂作用于HK- 2细胞Bax蛋白表达降低、Bcl- 2蛋白表达增加。

*P<0.05 compared with control group(0 μmol/L DDP); △P<0.05 compared with DDP(20 μmol/L); #P<0.05 compared with DDP(20 μmol/L) and CUR(10 μmol/L)+DDP(20 μmol/L)图4 不同组别Bcl- 2蛋白的表达Fig 4 Bcl- 2 protein level in different groups

为减轻顺铂的肾损伤，近年来研究者不断进行探索，除了氨磷汀、维生素C等抗氧化损伤的药物应用于临床外，主要仍停留在细胞和动物的研究阶段，并且这些药物的效果不确切。姜黄素与顺铂联用，从MTT与Western blot实验的结果分析可以得知：顺铂对HK- 2细胞具有强烈的增殖抑制作用；当使用姜黄素与顺铂联合用药时，姜黄素可以拮抗顺铂对HK- 2的增殖抑制作用。所以姜黄素作为顺铂的联合用药具有良好的前景，可以减轻恶性肿瘤患者顺铂的肾毒性。

[1] 《中国癌症防治三年行动计划(2015-2017年)》制订[J]. 中国肿瘤临床与康复，2016,23:177- 177.

[2] Wang Y,Liu Y,Liu Y,etal.A polymeric prodrug of cisplation based on pullulan for the targeted therapy against hepatocellular carcinoma[J].Int J Pharm,2015,483:89- 100.

[3] 崔亚萌，齐新，魏丽萍，等. 顺铂心脏毒性的研究进展[J]. 现代药物与临床，2017,32:351- 355.

[4] 张雪，俸婷婷，乔杨，等. 三种外源物诱导兔原代肾小管上皮细胞构建体外肾毒性模型的研究[J]. 中药药理与临床，2016,32:209- 213.

[5] 陈海滔，徐超，姚庆华. 姜黄素通过调节Wnt/β-catenin信号通路抑制结肠癌细胞上皮间质转化[J]. 肿瘤学杂志，2017,23:35- 39.

[6] Li Z,Pang L,Fang F,etal.Resveratrol attenuates brain damage in a rat model of focal cerebral ischemia via up-regulation of hippocampal Bcl- 2 [J].Brain Res,2012,1045:116- 124.

[7] 黎珊珊，徐兆发. 姜黄素激活Nrf2-ARE通路抑制镉肾毒性的研究进展[J]. 环境与健康杂志，2014,31:90- 93.

[8] Vickers AE, Rose K, Fisher R,etal.Kidney slices of human and rat characterize cisplatin-induced injury on cellular pathways and morphology[J].Toxicol Pathol,2004,32:577- 590.

[9] 李军，熊琨，龚元，等. 基于信号转导通路的姜黄素抗氧化机制研究进展[J]. 中草药，2016,47:2373- 2380.

[10] 程新燕，符翠莉.芹菜素对大鼠骨肉瘤细胞凋亡及相关蛋白Bax,Bcl- 2,caspase- 3,caspase- 9,细胞色素C的影响[J]. 中国实验方剂学杂志，2016,22:139- 142.