干巴菌物种复合群与云南松形成的外生菌根形态特征及分子鉴定*

魏杰，杨岳，李树红，张小雷，苏开美**

（1.内蒙古农业大学林学院，内蒙古呼和浩特010018；2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南昆明650223）

干巴菌（Thelephora ganbajun）属于担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes）非褶菌目（Aphyllophorales）革菌科（Thelephoraceae）革菌属（Thelephora）的一类真菌[1]。革菌属为世界广布属，Corner于1968年在其革菌属世界性专著中共报道51种[1]。我国目前的报道中有16种，其中云南产11种[2]。

干巴菌子实体呈扇状或莲座状瓣片，全菌干燥革质，在我国云南所指“干巴菌”一名，实际包括多种革菌类[3]。据报道，云南市场上的干巴菌主要有6种，即莲座革菌（Thelephora vialis Schw.）、橙黄革菌（T.aurantiotincta Corner.）、日本革菌（T.japonicaYasuda）、淡褐革菌[T.fuscella(Ces.)Lloyd]、掌状革菌[T.palmata(Scop.)Fr.]和干巴菌（T.ganbajunM.Zang）[2，4-5]。

干巴菌子实体与松科植物形成共生关系，多生于松林下。国外对革菌属Thelephora真菌的外生菌根研究较多，其中以T.terrestrisEhrh.的研究最多[6-8]。我国对Thelephora属真菌的外生菌根研究不多，目前为止仅对干巴菌的菌根做过初步研究。敬一兵[9-10]调查发现干巴菌的菌根颜色为灰白色至黑褐色，形状是珊瑚状至连续二叉式分枝状，但没有对干巴菌菌根的解剖结构进行研究。朱启顺和杨大智[11]不仅观察了干巴菌菌根的外部形态结构，同时还对干巴菌的菌套特征进行了描述，但是，他们都没有对该菌根进行分子鉴定。

Sha等[12]对中国西南地区干巴菌的遗传多样性进行了研究，结果表明，干巴菌可能是1个种的集群，包含了很多隐存种。干巴菌可与云南松（Pinus yunnanensisFranch.）、思茅松[P.kesiyaRoyle ex Gord.var.langbianensis(A.Chev.)Gaussen]和滇油杉（Keteleeria evelynianaMast.）具有非专一性密切的共生关系[2]。因此，干巴菌形成的菌根形态类型也可能有很多种，这就需要对干巴菌的外生菌根进行广泛的研究。

本文根据Agerer的外生菌根描述，系统详细描述了干巴菌与云南松形成的外生菌根的外部形态和内部解剖结构特征，并首次运用分子生物学方法进行了系统发育分析。

1 材料与方法

1.1 干巴菌子实体和菌根采集方法

1.1.1 子实体和菌根采集地点

本研究中干巴菌子实体（如图1A所示）和菌根，采自云南省昆明市宜良县狗街镇小哨村云南松林中，干巴菌生长林地的土壤是红壤，成林树种是云南松，林下有少量杜鹃和野胡椒等。

1.1.2 子实体和菌根采样

寻找到干巴菌子实体后拍照并记录生境，用小刀切取一部分干巴菌子实体用于分子鉴定。为了保护干巴菌的菌塘，在子实体基部外围1 cm～30 cm的土壤内，沿着云南松的根系寻找侧根。小心找到干巴菌子实体基部根状菌索，并顺着根状菌索用镊子轻轻剥离土壤寻找外生菌根。用枝剪剪下带有外生菌根的侧根并用泥土包裹装袋并进行编号，将子实体和外生菌根带回实验室。

1.1.3 子实体和菌根处理

将新鲜子实体放入冰箱内冷藏用于分子鉴定。把采集到的带有侧根的土壤用自来水浸泡20 min后，在OLYMPUS SZX16体式显微镜下用解剖针或者镊子挑去粘在菌根上的泥土杂物，并用小刷子清洗。将洗干净的侧根放到干净的盛水培养皿中在解剖镜下观察。

1.1.4 菌根形态观察

用镊子挑取菌根系统的1个未分支末端，放在滴有1滴水的载玻片上，在解剖镜下用镊子夹住未分支末端的根部，用锋利的解剖针剥下菌套，压片，在Nikon ECLPSE 80i显微镜下观察并描述菌套特征，并用Nikon Y-Tv55照相。菌套描述按照Agerer的描述系统。剩余的菌根用FAA固定液和CTAB分别保存，用于以后的观察和分子生物学鉴定[13-15]。

1.2 分子鉴定

干巴菌子实体和菌根的DNA提取，采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒（植物），生工生物工程（上海）有限公司。PCR扩增反应在Eppendorf Maseter cycler PCR仪上进行。50 μL的PCR扩增反应体系组成包括：25 μL 2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰克生物技术有限公司），引物ITS1F和ITS4各2 μL，DNA模板1 μL，加双蒸水补足50 μL。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃后延伸10 min。PCR产物的纯化和测序交由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。序列的编辑采用bioedit完成。

将该干巴菌子实体和菌根的序列与GenBank数据库中的序列进行比对（BLAST），将同源性最高的序列下载下来作为参考。并根据王鹏飞[16]的研究，将干巴菌模式标本序列和近似系统种序列都下载下来用于本研究的系统发育分析中。使用MEGA软件（v7.0.14）进行Alignment，然后使用Phylogenetic Analysis中的Construct/Test Neighbor-Joining（NJ）邻接法，将Bootstrap设为1 000次进行建树，最后对所建系统发育树进行调整并保存。

2 结果与分析

2.1 干巴菌外生菌根形态和解剖结构特征

干巴菌外生菌根形态和解剖结构特征见图1。

2.1.1 形态特征

菌根系统二叉分支（0～5级），亲水。未分支末端直，幼时黄色，老时棕褐色，长4 mm～7.6 mm，直径3.5 mm～4.8 mm，表面光滑，有少量的外延菌丝，成稀疏的羊毛状（如图1B所示）。

图1 干巴菌隐存种子实体及外生菌根的形态和解剖结构图Fig.1 Fruitbody of cryptic species of Thelephoraganbajun,morphology and anatomy of ectomycorrhizae

2.1.2 解剖结构特征

菌套表面有菌丝网，由膨大的细胞连接形成（如图1C所示），菌丝细胞直径4 μm～8 μm。外层菌套为密丝组织，菌丝无色，直径3 μm～8 μm，细胞壁薄，有些菌丝有锁状联合（如图1D所示）。中层菌套为密丝组织，菌丝无色，直径3 μm～5.5 μm，有些菌丝有锁状联合（如图1E所示）。内层菌套也为密丝组织，菌丝无色，直径3 μm～5.5 μm，有些菌丝有锁状联合（如图1F所示）。

外延菌丝无色，直径4.5 μm～5.5 μm，细胞壁薄，菌丝表面光滑。分支多，分支处有锁状联合（如图1G所示）。菌丝有接合现象，接合处无隔或无锁状联合，呈“H”型（如图1H所示）。

2.2 干巴菌外生菌根分子鉴定结果

基于ITS片段构建的革菌系统发育树见图2。

由图2可知，以Tomentella stuposa做外类群，用NJ法构建系统发育树显示，本研究中的干巴菌子实体及外生菌根序列与5个干巴菌子实体序列聚在一起，形成1个独立的分支clade1，且bootstrap为100%。同时还有2个干巴菌序列EU696827和EU696946形成1个独立分支clade2，bootstrap为87%。

图2 基于ITS片段构建的革菌系统发育树Fig.2 ITS phylogenetic tree of Thelephora

3 讨论

在革菌属中，至今描述最多的是T.terrestris的外生菌根，它的形态结构具有如下特征：菌根带褐色的，亲水；菌套属于D型，即外层菌套为密丝组织且带有锥状的囊状体；根状菌索为thelephoroid，即根状菌索的菌丝有轻微区别，外围菌丝的直径要小于中间菌丝；外延菌丝有锁状联合，菌丝接合处为“H”型[17]。本研究中的菌根与T.terrestris菌根的共同之处在于：菌根呈褐色，亲水；均具有密丝组织的菌套；外延菌丝有锁状联合，且菌丝接合处无隔或无锁状联合。但也存在不同之处：本研究中的菌根菌套表面由膨大的细胞连接形成菌丝网，无典型的锥状囊状体，且基部有锁状联合的囊状体是最大的不同之处。

本研究中菌根具有二叉分支，菌根呈黄褐色，外层、中层和内层菌套为密丝组织，菌丝有锁状联合且有“H”型的菌丝细胞接合现象，与朱启顺和杨大智对T.ganbajun菌根的观察结果相同[11]。但本研究中观察到的菌套表层具有由膨大细胞形成的菌丝网，这在他们的研究中未提及。

系统发育树显示，该菌根序列与本研究采集的干巴菌子实体序列以及5个定名为干巴菌的序列在1个独立分支clade1中，且bootstrap值非常高。但这5个序列都非源自干巴菌模式标本。虽然王鹏飞等[16]通过不懈的努力后获得了干巴菌模式标本的ITS序列，但是在GeneBank中没有找到该序列，因此本研究中并没有加入干巴菌模式标本序列。但在他的研究中有2个序列，即EU696827和EU696946与模式标本的ITS序列形成1个独立分支，这两个序列在本研究中也形成一个独立分支clade2。Sha等把未与干巴菌（Thelephora ganbajun）模式标本序列形成单系分支的干巴菌定义为干巴菌的隐存种[12，16]。因此，本研究中的菌根是由干巴菌隐存种与云南松形成的外生菌根。

Sha等[12，16]的研究还认为目前分布在云南地区（除普洱地区）被认为是干巴菌的真菌，很可能是Tomentella属的1个或几个新种[12]。目前的菌根研究结果表明，除Tomentella ferruginea和Tomentella brunneorufa具有密丝组织的外层菌套外，绝大多数已研究的Tomentella形成的菌根具有拟薄壁组织结构的外层菌套。谢雪丹和刘培贵[18]对云南松6个棉革菌外生菌根进行了形态和解剖结构观察，所有6个Tomentella外生菌根的外层菌套均为拟薄壁组织。外层菌套结构不是唯一鉴定Thelephora和Tomentella的标准，随着解剖结构特征结合分子生物学方法的发展，外生菌根的形态研究也许可以为Thelephora-Tomentella真菌的分类提供一些依据，并为发现“T.ganbajun”的隐存种提供线索。

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