高效液相色谱法测定营养品中的虫草素

郑国建，李 珊

（雅培贸易（上海）有限公司，上海200233）

营养品中含有人体欠缺及损失的营养成分，这些成分是保持身体健康的必要物质。随着人们生活水平的提高，健康意识越来越强，我国营养品市场存在较大发展空间。

虫草素的化学名称为3′－脱氧腺苷，是冬虫夏草和蛹虫草的主要活性成分之一［1］。有研究表明虫草素可改善缺血小鼠的学习能力，促进海马神经元的修复［2］，可抑制肺癌细胞株的增值和迁移过程［3］，具有消炎［4］、抗肿瘤［5］、调节人体免疫功能等显著作用。基于虫草素的上述功能，将虫草素添加到营养品中可极大地提高产品附加值，可调节人体的生理机能，为消费者提供营养支持。

目前测定虫草素的方法主要用于测定冬虫夏草、蛹虫草及其发酵液中的虫草素含量［6－9］，但是没有用于测定营养品中虫草素的方法。营养品基质复杂，含有淀粉、麦芽糊精、多种营养素和矿物质，容易对测定结果造成干扰。本工作采用高效液相色谱法测定营养品中虫草素的含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪，配二元泵、在线真空脱气机、自动进样器、进样器温控、柱温箱、多波长检测器（MWD）；Milli－Q型纯水系统。

虫草素标准储备溶液：200.0mg·L－1，称取标准品20.00mg于100mL容量瓶中，用水溶解并定容，在－20℃冰箱中保存，备用。

偏磷酸溶液：30.0g·L－1，称取偏磷酸30.00g于装有约600mL水的1L烧杯中，在磁力搅拌器上溶解，转移至1L容量瓶中，用水定容。

偏磷酸为分析纯，乙腈为色谱纯，试验用水为纯水。

1.2 色谱条件

Phenomenex Gemini C18色 谱 柱 （250mm×4.6mm，5μm）；柱温35℃；流量1.0mL·min－1；进样量20μL；流动相A为水，B为乙腈。梯度洗脱程序：0～16.0min时，A 为95%；16.0～16.1min时，A由95%线性降至10%；16.1～23.0min时，A为10%；23.0～23.1min时，A 由10%线性升至95%；23.1～30.0min时，A 为95%。紫外检测波长为260nm。

1.3 试验方法

称取营养品样品10.00g，加水至50.00g，加入磁力搅拌子，在磁力搅拌器上搅拌10min，使其充分溶解。从稀释好的样品里称取2.50g溶液至50mL容量瓶中，加水30mL，混匀，超声10min，加入30.0g·L－1偏磷酸溶液1.0mL，轻轻振荡，加水稀释至刻度，样品经0.22μm滤膜过滤后进液相色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 样品预处理条件的选择

试验使用速溶虫草素作为营养品的原料，采用干法工艺的方式进行添加，所以在样品处理过程中要对样品进行复溶，以尽可能减少由于样品不均匀造成的测定值波动。

农业行业标准 NY／T 2116－2012［10］中使用水直接提取样品中的虫草素。但是在试验中发现如果只加水溶解提取营养品中的虫草素，得不到澄清的液体，不利于后续的液相色谱分析。所以样品处理过程中应加入适当的沉淀剂。

沉淀样品中干扰物质的方法主要包括有机溶剂沉淀法［11］、盐沉淀法［12］及酸碱沉淀法［11］。鉴于对操作人员的身体健康及沉淀效果的考虑，试验使用30.0g·L－1偏磷酸溶液。

试验发现偏磷酸溶液用量会改变虫草素的出峰时间，其出峰时间随偏磷酸溶液用量的增加而减少。这会导致虫草素不能和杂质分离，且在后续的色谱图定量过程中造成处理软件找不到对应的目标峰。试验确定30.0g·L－1磷酸溶液1.0mL已可沉淀样品，且不对虫草素的出峰时间和分离造成影响。

2.2 色谱条件的选择

试验考察了SB C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）、XDB C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）和 Gemini C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）对目标物的分离效果，结果发现：Gemini C18色谱柱可以很好地将虫草素和杂质分离，其他两种色谱柱会存在基质干扰。所以试验选择Gemini C18色谱柱。

在最佳色谱条件下对空白基质、标准溶液及阳性样品进行分析，其色谱图见图1。

图1 空白基质、标准溶液和阳性样品的色谱图Fig.1 Chromatograms of blank matrix，standard solution and positive sample

由图1可知，目标物得到了很好的分离，没有基质干扰。

2.3 标准曲线及检出限

按试验方法对0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，1.00mg·L－1的虫草素标准溶液进行测定，结果表明：虫草素的质量浓度在0.05～1.00mg·L－1内与其峰面积呈线性关系，线性回归方程为y＝57.7 x，相关系数为0.999 9。

采用在空白基质中添加目标物的方法，以10倍信噪比计算得到虫草素的测定下限（10S／N）为5.0mg·kg－1。

2.4 精密度与回收试验

取空白营养品样品若干份，分别加入虫草素标准溶液，使样品中虫草素的质量比分别为5.0，40.0，60.0mg·kg－1，按试验方法平行测定6次，计算回收率及测定值的相对标准偏差，结果见表1。

表1 精密度与回收试验结果（n＝6）Tab.1 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

由表1可知：加标回收率在100%～102%之间，测定值的相对标准偏差在1.5%～3.4%之间。

2.5 方法准确性

使用NY／T 2116－2012中描述的方法对虫草素原料进行测定，同时使用本方法分析添加了该虫草素原料的营养品，其中每54.8g营养品中含1g虫草素原料。

分别测定原料和营养品各6次，取平均值。原料中虫草素的质量比为1.97mg·g－1，所以营养品中虫草素质量比的理论值为35.95mg·kg－1。使用本方法实际测得营养品中虫草素的质量比为35.32mg·kg－1。测定值和理论值的相对误差为1.8%。

本工作建立了测定营养品中虫草素含量的方法，对样品前处理中的沉淀剂进行了优化，最终选择30.0g·L－1偏磷酸溶液1.0mL作为沉淀剂。该方法稳定、可靠、准确，适用于营养品中虫草素的测定。

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