高效液相色谱－电感耦合等离子体质谱法同时测定海产品中9种砷形态化合物

陆奕娜，魏建华，许 慨，张林田，陈建伟

（汕头出入境检验检疫局，汕头515031）

海洋生物中砷化合物的含量较高，是人体摄入砷的重要来源［1］。常见的砷化合物有亚砷酸［As（Ⅲ）］、砷酸［As（Ⅴ）］、一甲基砷酸（MMA）、二甲基 砷 酸 （DMA）、砷 甜 菜 碱 （AsB）、砷 胆 碱（AsC）［2］、洛 克 沙 砷 （ROX）、4－氨 基 苯 砷 酸 （p－ASA）、2－氨基苯砷酸（o－ASA）［3］等。不同形态的砷毒性差异很大［4］，其中无机砷 As（Ⅲ）和As（Ⅴ）毒性最大［5］，甲基胂酸（MMA）和二甲基胂酸（DMA）等有机胂的毒性较小，而砷甜菜碱（AsB）、砷胆碱（AsC）通常被认为无毒［6－7］。

有机胂剂（洛克沙胂、阿散酸）具有抗寄生虫病、促进动物生长［8］、改善动物生产品质等多重作用，在畜牧养殖业中被大量使用。这些含砷的排泄物或以有机肥料进入农田，或直接排至鱼塘、河流、海洋［9］。2004年，在中国则有6×106kg的砷进入环境中［10］，并随着食物链进入水产品中。

目前，砷形态分析大多采用高效液相色谱和电感耦合等离子体质谱联用技术［11］。本工作利用高效液相色谱和电感耦合等离子体质谱联用技术，建立同时快速测定海产品中9种砷形态化合物的分析方法，以期为海产品的质量控制提供技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100型高效液相色谱仪，配四元泵及自动进样器；Agilent 7700X型电感耦合等离子体质谱仪；CBL C9860A型超声波萃取仪；Hettich型高速离心机；BUCHI型多平行样品蒸发仪；Milliplus 2150型超纯水处理系统。

砷标准物质：As（Ⅲ）［GBW 0866，（124.3±2.0）mg·L－1］、As（Ⅴ）［GBW 08667，（32.4±0.7）mg·L－1］、MMA［GBW 08668，（46.2±1.5）mg·L－1］、DMA［GBW 08669，（97.4±3.3）mg· L－1］、AsB［GBW 08670，（92.2±2.7）mg·L－1］、AsC［GBW 08671，（91.6±3.7）mg· L－1］、ROX （16820200）、p－ASA（10300250）、o－ASA（F58WD－HK），均购于国家标准物质研究中心，使用前用水配制成1.00mg·L－1标准储备溶液，于0～5℃避光保存。

乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液：200mmol·L－1，称取EDTA 7.444 8g溶于100mL水中。

1.2 仪器工作条件

1）ICP－MS条件 射频功率1 450W，测质量数75（As），采样周期为0.8s，采集时间为1 200s，载气为高纯氩气，同心雾化器，载气流量为1.00L·min－1。

2）HPLC条件 Hamilton PRP－X100阴离子分析柱（250mm×4mm，10μm）；流动相 A 为0.5mmol·L－1（NH4）2CO3溶液－甲醇（99＋1），用氨水调pH 至8.5，流动相B为50mmol·L－1（NH4）2CO3溶液－甲醇（99＋1），用甲酸调pH 至8.5；进样量25μL。梯度洗脱程序：0min时，A为100%，流量为1.0mL·min－1；1～8min，B 为100%，流量为1.0mL·min－1；9～18min时，B为100%，流量为1.1mL·min－1；19～20min时，A为100%，流量为1.0mL·min－1。

1.3 试验方法

称取均质后的样品1.000 0g于50mL离心管中，加入流动相A 38mL混匀，超声萃取2h，再加乙酸2mL，加水定容至50mL，混匀。于4℃冰箱中静止10min后，取清液以14 000r·min－1转速离心15min，吸取上清液过0.22μm滤膜至进样小瓶供HPLC－ICP－MS测定。如果离心后的溶液出现浑浊现象，则将离心机温度设置为6℃重新离心，样品中的油脂分层凝固在离心管上层，用小勺小心去除；或离心完成后将离心管置于冰箱冷藏保存2～3h以上，取出后去除上层油脂层，取1mL溶液再过0.22μm 滤膜至进样小瓶供 HPLC－ICP－MS测定，上机前加入200mmol·L－1的EDTA溶液50μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

试验考察了淋洗液流量为0.8～1.3mL·min－1对保留时间和分离度的影响。结果表明：随淋洗液流量的增加，保留时间缩短，流量为0.8mL·min－1时，9种砷形态化合物的完全出峰时间太长，需要25min才能洗脱完毕；流量为1.0mL·min－1时，23min内完全出峰。由于前7种砷形态化合物的出峰时间比较短，流量不用设置太大，前期流量设置为1.0mL·min－1。后两种砷形态化合物的出峰时间较长，因此将后期的流量加快，分别设置为1.1mL·min－1、1.3mL·min－1、1.5mL·min－1，对应的色谱图见图1。

由图1可知：加快流量能加快后两种砷形态化合物的出峰，1.1mL·min－1流量比1.0mL·min－1流量能明显加快后两种砷化合物的出峰，但是当流量提高至1.3mL·min－1及1.5mL·min－1时，出峰时间加快效果不明显，从保护色谱柱及色谱仪的角度出发，试验将流量设置为前期的1.0mL·min－1及后期的1.1mL·min－1。最终9种砷形态化合物在20min内达到基线完全分离。

图1 不同流量下9种砷形态化合物的色谱图Fig.1 Chromatograms of nine arsenic species under different flow rates

2.2 质谱条件的优化

2.2.1 射频功率

试验考察了射频功率分别为 1 000，1 050，1 100，1 150，1 200，1 250，1 300，1 350，1 400，1 450，1 500，1 550，1 600W 对灵敏度及氧化物、双电荷的影响，结果见图2，图3。

图2 射频功率对灵敏度的影响Fig.2 Effects of radio frequency power on sensitivity

由图2可知：Y89的计数即灵敏度随着射频功率的增加呈现先增后略减的趋势，当射频功率在1 450～1 500W 时，Y89的灵敏度最高。从图3可以看出：随着射频功率的增加，氧化物急剧减少而双电荷先减后增，其原因是随着射频功率的增加，矩管中心温度升高，导致氧化物解离和双电荷形成。射频功率为1 450～1 600W 时，灵敏度、氧化物和双电荷都能满足调谐要求。为了减少质谱干扰，试验选择射频功率为1 450W。

图3 射频功率对氧化物、双电荷的影响Fig.3 Effects of radio frequency power on oxides and double－charges

2.2.2 载气流量

试验考察了载气流量分别为0.80，0.85，0.90，0.95，1.00，1.05，1.10，1.15，1.20mL·min－1对灵敏度及氧化物、双电荷的影响，结果见图4，图5。

由图4可知：随着载气流量的增加，灵敏度呈现先增加后减少的趋势，当流量在1.00～1.05mL·min－1时灵敏度最大。由图5可知：载气对双电荷的干扰呈现先略少后增加的趋势，氧化物的干扰则也是先略少后急剧增加。载气流量设置在1.00～1.05mL·min－1时，仪器灵敏度、氧化物、双电荷均最佳。为了在提高灵敏度的同时减少氧化物的干扰，试验选择载气流量为1.00mL·min－1。

2.2.3 辅助气流量

试验考察了辅助气流量对灵敏度及氧化物、双电荷的影响，结果见图6，图7。

图4 载气流量对灵敏度的影响Fig.4 Effects of gas flow rate on sensitivity

图5 载气流量对氧化物、双电荷的影响Fig.5 Effects of carrier gas flow on oxides and double charges

图6 辅助气流量对灵敏度的影响Fig.6 Effects of auxiliary gas flow rate on sensitivity

由图6可知：随着辅助气流量的增加，灵敏度呈现下降的趋势，辅助气流量为0的情况下，灵敏度最大。由图7可知，辅助气对双电荷及氧化物的干扰随着流量的增加而增加。因此，试验不使用辅助气。

图7 辅助气流量对氧化物、双电荷的影响Fig.7 Effects of auxiliary gas flow rate on oxides and double charges

2.3 前处理的优化

2.3.1 萃取时间

对萃取时间做单因素试验，取蓝圆鲹及方斑东风螺样品，按萃取时间分别为 30，60，90，120，150min进行萃取，测定结果见图8和图9，由于As（Ⅲ）、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA、ROX及o－ASA不同萃取时间的测定结果均小于检出限，图中只对检出项目AsC、AsB、DMA、p－ASA（方斑东方螺检出）进行对比。由试验结果可知：120min为萃取的最佳时间，既可保证最大提取效率，又可节约试验时间。

图8 萃取时间对砷化合物提取效率的影响Fig.8 Effects of extraction time on extraction efficiency of arsenic species

2.3.2 萃取温度

为了验证萃取温度是否造成砷形态之间的转化及损失，对萃取温度做了单因素试验。在空白样品（罗非鱼）中添加40μg·kg－1的9种砷形态化合物标准物质进行超声，通过加入冰块将萃取温度控制在20，30，40，50℃及不加入冰块不控制温度（实测最高55℃）进行120min萃取，与不超声直接上机测定的结果作比较，测定结果见表1。

表1 超声萃取温度对砷形态化合物测定结果的影响Tab.1 Effects of ultrasonic extraction temperatures on determination results of arsenic species μg·kg－1

由表1可知：萃取温度在2h内对9种砷形态化合物的测定没有明显的影响，不会造成砷形态之间的互相转化。

2.3.3 萃取次数

在萃取过程中，萃取次数对回收率有着重要影响，萃取次数如不够，萃取不完全，目标物损失较多，而萃取次数过多，既造成试剂浪费又造成检测时间太长，工作效率低。以检出砷形态化合物种类较多的三疣梭子蟹为研究对象，按试验方法萃取3次，比较3次提取液中各砷形态化合物的测定值，结果见表2。

表2 萃取次数对测定结果的影响Tab.2 Effects of extraction times on determination results μg·kg－1

由表2可知：按照2h超声萃取一次，被测物基本已经萃取完全，有很少一部分被测物残留在残渣里，比例不到2%，主要是萃取后的残渣没有沥干，残渣吸附的液体中含有极少的砷化合物。第三次提取液中9种砷形态化合物均为未检出。考虑到试验时间及萃取效率，且第二次萃取的残留量极低，试验确定的萃取次数为一次。

2.4 标准曲线及测定下限

移取 0，1.0，5.0，10，20，40，80，100mL 的AsC、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA、ROX、o－ASA（AsB 再添加 200，400mL）质量浓 度为1.00mg·L－1的各标准储备溶液，用水定容至1L，配制成0，1.0，5.0，10，20，40，80，100μg·L－1（AsB增加200，400μg·L－1两个级别）的混合标准溶液系列，上机前加入200mmol·L－1的EDTA溶液50μL，按仪器工作条件进行测定，以峰面积对各砷形态化合物的质量浓度进行线性回归。结果表明，9种砷形态化合物的质量浓度在100μg·L－1内与对应峰面积呈线性关系，线性回归方程及相关系数见表3。

采用 1.0μg·L－1的 AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA 及2.0μg·L－1的ROX、o－ASA共9种砷形态化合物混合标准溶液的色谱图，选取一段噪声，以峰对峰计算信噪比。以10倍信噪比计算测定下限。确定 HPLC－ICP－MS联用技术检测鱼类、虾类、贝类、蟹类等水产品中AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA的测定下限为50μg·kg－1，ROX、o－ASA的测定下限为100μg·kg－1。

2.5 精密度与回收试验

试验同时选择罗非鱼阴性样品在测定下限的1，2，10倍添加标准溶液，按试验方法进行测定，回收率在74.0%～109%之间，6次测定结果的相对标准偏差在5.4%～13%之间。

表3 线性参数与测定下限Tab.3 Linearity parameters and lower limits of determination

2.6 样品分析

按试验方法同时测定汕头市海域附近的鱼、虾、蟹类等海产品中9种砷形态化合物的含量，结果见表4。

表4 海产品中9种砷形态化合物测定结果Tab.4 Determination results of 9arsenic species in marine products μg·kg－1

由表4可知：样品中的砷主要以砷甜菜碱（AsB）形式存在，较多的样品含有少量的 AsC，DMA及 MMA检出较少，毒性较大的As（Ⅲ）、As（Ⅴ）含量较低，且无机砷含量即 As（Ⅲ）与As（Ⅴ）总和均小于GB 2762－2012《食品安全国家标准 食品中污染物限量》［12］中无机砷的限量要求，样品基本不含有有机胂制剂p－ASA、ROX、o－ASA。

本工作通过对质谱、色谱条件的优化，使AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA、ROX及o－ASA等9种砷形态化合物在20min内得以分离，基线平稳，是目前文献分离项目较多的方法之一。其中AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）在8min内得以完全分离，是目前文献中出峰速率最快的。同时采用适当简便的前处理技术提取样品中9种砷形态化合物，该方法能快速地分析水产品中9种砷形态化合物。试验收集到的样品中，所有样品均检出AsB，且含量占绝对优势，即采集到的样品中砷主要以无毒的AsB形式存在，与文献［13－17］报道相符；较多的样品含有AsC；毒性较大的As（Ⅲ）、As（Ⅴ）较少检出且含量比较低；MMA及DMA检出同样较少；基本不含有有机胂制剂p－ASA、ROX、o－ASA。

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