极谱法测定牛奶中的三聚氰胺

吉 喆，陈 文，王 铒，杨 捷

（成都理工大学 材料与化学化工学院，成都610059）

三聚氰胺［C3N3（NH2）3］是一种化工原料。因其含氮量高达66.7%，所以很多不法分子将其加入牛奶或者蛋白饲料中，造成蛋白质含量高的假象。由于其具有毒性，被人或动物食用后会导致结石及肾衰竭［1］。2012年，联合国国际食品法典委员会设定了牛奶中三聚氰胺含量新标准，规定每千克液态牛奶中三聚氰胺质量最大允许值为0.15mg。因此准确快速地测定食品中三聚氰胺的含量显得尤为重要。

目前牛奶及蛋白饲料中三聚氰胺的测定方法主要有气相色谱－质谱法（GC－MS）［2－3］、高效液相色谱法（HPLC）［4－6］和 高 效 液 相 色 谱－质 谱 法 （HPLCMS）［7－8］等。电 化 学 检 测 三 聚 氰 胺 多 见 传 感 器［9－11］或电化学发光［12－13］。文献［14］使用单扫描极谱法在NaOH－KCl底液中直接测定三聚氰胺，检出限为1.73×10－3mg·L－1，未进行共存物质的影响、干扰的消除和样品的前处理方法等研究。文献［15］也采用极谱法直接分析经NaCl处理过的牛奶样品，检出限为0.1mg·L－1，也未做共存物质的影响研究，且样品分析的回收率较低。

采用极谱法间接测定三聚氰胺的报道鲜见，本工作提出一种利用三聚氰胺对荧光素还原峰的抑制作用，间接测定三聚氰胺的极谱法，研究初步讨论检测三聚氰胺的极谱机理，对三聚氰胺的极谱检测具有一定的理论意义。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

JP－3型示波极谱仪，配三电极体系：滴汞电极为工作电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，铂电极为辅助电极。UV－2700型可见分光光度计；pHS－25型pH计；BS－2245型电子分析天平。

三聚氰胺标准储备溶液：1.0×10－3mol·L－1，称取三聚氰胺0.012 6g，用水溶解并定容至100mL容量瓶中，在低温密封和避光条件下保存。使用时用水稀释至所需浓度。

荧光素标准储备溶液：1.0×10－3mol·L－1，称取荧光素0.033 2g，滴加数滴0.2mol·L－1NaOH溶液以溶解，用水溶解并定容至100mL容量瓶中，在低温密封和避光条件下保存。使用时用水稀释至所需浓度。

磷酸盐缓冲溶液（PBS）、乙酸－乙酸钠缓冲溶液、柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液、B－R缓冲溶液均按所需浓度配制。

荧光素为色谱纯，其他试剂均为分析纯，试验用水为一次蒸馏水。

1.2 仪器工作条件

起始电位－0.4V（vs.SCE），扫描速率0.4V·s－1，静止时间5s，扫描次数为3，量程0～2.5×103nA，恒温测定。

1.3 试验方法

移取牛奶样品0.20mL于4mL离心管中，加入乙腈（25＋75）溶液1.8mL，超声分散10min，沸水浴加热10min，以10 000r·min－1转速离心8min，取上清液通过0.22μm有机滤膜，取滤液蒸发去除乙腈至溶液澄清，得样品溶液。

依次将0.2mol·L－1B－R 缓冲溶液7.5mL（用0.2mol·L－1NaOH 溶液配制，pH 6.5）、1.0×10－4mol·L－1荧光素标准溶液2.5mL、一系列三聚氰胺的标准溶液或适量样品溶液加入25mL比色管中，用水稀释至刻度，摇匀，于45℃恒温水浴中加热15min，取适量于10mL小烧杯中，在仪器工作条件下记录二阶导数波峰的峰电位（Ep）与峰电流（Ip），由ΔIp＝Ip－I0计算加入三聚氰胺前后峰电流的变化（I0为未加三聚氰胺时的峰电流）。

2 结果与讨论

2.1 极谱行为

分别对荧光素标准溶液、B－R缓冲溶液、荧光素标准溶液＋B－R缓冲溶液、B－R缓冲溶液＋荧光素标准溶液＋三聚氰胺标准溶液进行极谱扫描，结果见图1。

图1 二级导数极谱图Fig.1 Second－order derivate polarograms

由图1可知：荧光素标准溶液、B－R缓冲溶液各自在扫描范围内无峰；当上述两种溶液混合后，在－0.86V处有一个还原峰，说明荧光素在该缓冲体系的酸度下具有还原性；加入三聚氰胺标准溶液后在－0.86V处的还原峰降低。试验发现随着三聚氰胺浓度的增加，峰电流逐渐减小，表现出与三聚氰胺浓度的显著相关性，推断三聚氰胺加入后与荧光素结合形成了非电化学活性的物质，降低了溶液中游离荧光素的浓度，从而使其峰电流下降。

2.2 试验条件的选择

2.2.1 缓冲溶液及其酸度和用量

试验选择在三聚氰胺浓度为1.0×10－5mol·L－1（高）、1.0×10－6mol·L－1（低）时考察了缓冲溶液酸度对峰电流的影响，结果见图2。

图2 缓冲溶液酸度对峰电流的影响Fig.2 Effect of acidity of buffer solution on peak current

由图2可知：pH 6.5是最佳的酸度条件。试验进一步研究了最佳酸度下不同的缓冲体系包括PBS缓冲溶液、乙酸－乙酸钠缓冲溶液、柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液、B－R缓冲溶液中荧光素的极谱行为，结果表明：在0.2mol·L－1B－R缓冲溶液中极谱波峰电流最大最稳定，且无杂峰出现。

分别配制 1.0×10－5mol·L－1（高）、1.0×10－6mol·L－1（低）的三聚氰胺标准溶液，按照试验方法对B－R缓冲溶液的用量进行了选择，结果见图3。结果表明缓冲溶液的最佳用量为7.5mL。

图3 B－R缓冲溶液用量对峰电流的影响Fig.3 Effect of B－R buffer solution volume on peak current

综上所述，最佳底液条件为25mL体积中加入pH 6.5的0.2mol·L－1B－R缓冲溶液7.5mL。

2.2.2 荧光素用量

试验考察了电极反应物荧光素的用量对峰电流的影响，结果见图4。

由图4可知：当荧光素加入量为1.0×10－5mol·L－1时，ΔIp较大。因此，试验选择荧光素浓度为1.0×10－5mol·L－1。

2.2.3 反应温度和反应时间

按照试验方法，在最佳底液的条件下分别配制1.0×10－5mol·L－1（高）、1.0×10－6mol·L－1（低）的三聚氰胺标准溶液，考察了反应温度（25～50℃）以反应时间（5～30min）对峰电流的影响，结果见图5和图6。

图5 反应温度对峰电流的影响Fig.5 Effect of reaction temperature on peak current

由图5和图6可知：在45℃下反应15min反应可以达到平衡，并有较高的峰电流。因此，试验选择45℃水浴反应15min后测定。

2.3 仪器工作条件的选择

按照试验方法，在最佳底液的条件下分别配制1.0×10－5mol·L－1（高）、1.0×10－6mol·L－1（低）浓度的三聚氰胺标准溶液，分别考察了汞柱高度、扫描速率、起始电位、静止时间对峰电流的影响。在30～50cm内改变汞柱高度，在0.2～0.8V·s－1内改变电极扫描速率，在－0.2～－0.7V内改变起始电位，在2～8s内改变滴汞静止时间，选择出最佳的仪器工作条件为：汞柱高度45cm；扫描速率0.4V·s－1；起始电位－0.4V；静止时间5s。

图4 荧光素浓度对峰电流的影响Fig.4 Effect of fluorescein concentration on peak current

2.4 共存物质的影响

在最佳条件下考察一些常见的共存离子对测定1.0×10－6mol·L－1三聚氰胺标准溶液的影响，结果见表1。

表1 干扰试验结果Tab.1 Results of interference test

由表1可知：乳制品中常见的K＋、Na＋、Mg2＋、Cl－对三聚氰胺的测定基本无干扰；Ca2＋在低浓度下干扰很小，高浓度时在测定体系中会产生沉淀，系钙离子与缓冲溶液反应生成磷酸盐沉淀所致，但并未和三聚氰胺相互作用，故取上清液进行分析，结果不受影响。三聚氰胺的副产物三聚氰酸在100倍共存量下不产生干扰。

2.5 标准曲线与检出限

配制一系列三聚氰胺标准溶液，按照试验方法测定其峰电流，绘制标准曲线。三聚氰胺浓度在1.0×10－7～1.0×10－5mol·L－1与峰电流呈线性关系，线性回归方程为 ΔIp（×102nA）＝－0.029 5 c＋1.161，相关系数为0.996 8。

按照试验方法配制不加三聚氰胺的荧光素溶液，并对溶液进行10次连续测定，以3s／k（s为10次测定值的相对标准偏差，k为标准曲线斜率）计算方法的检出限为5.1×10－8mol·L－1。

2.6 精密度与稳定性试验

在最佳底液的条件下分别配制1.0×10－5mol·L－1（高）、1.0×10－6mol·L－1（低）的两组（各10个）三聚氰胺标准溶液，在相同条件下进行测定，测定值的相对标准偏差（RSD）分别为0.83%，0.57%。对两组三聚氰胺标准溶液考察发现，在12h内都可以稳定测定三聚氰胺溶液。

2.7 样品分析

按试验方法对市售牛奶样品进行分析，样品中均未检出三聚氰胺，并进行加标回收试验，结果见表2。

表2 回收试验结果Tab.2 Results of test for recovery

由表2可知：加标回收率在91.2%～99.1%之间，说明该方法测定乳制品样品中的三聚氰胺有较好的准确度。

3 极谱机理分析

3.1 反应的光谱法表征

在1.0×10－5mol·L－1三聚氰胺标准溶液中加入荧光素，分别在加热和不加热的条件下、在可见光波长范围内进行扫描，同时在相同条件下对荧光素－B－R溶液也进行扫描，结果见图7。

图7 可见光吸收光谱图Fig.7 Visible light absorption spectra

由图7可知：在490nm处荧光素－B－R溶液有一特征吸收峰（曲线1）；加入三聚氰胺后吸收峰有明显降低（曲线2），说明荧光素的浓度降低，这与极谱试验结果相符；且反应时进行加热的溶液，其吸光度有明显的降低（曲线3），说明加热可加快反应速率，使得反应更快达到平衡状态。

3.2 反应的电化学分析

按照试验方法对1.0×10－6mol·L－1三聚氰胺标准溶液进行循环伏安法测试。正向扫描时有还原峰出现，峰电位与单向扫描极谱法出现还原峰的位置一致，而反向扫描时对应的电位上并无氧化峰，说明该极谱波为不可逆吸附波。

在最佳仪器工作条件下对5.0×10－6mol·L－1三聚氰胺标准溶液于0.1～0.8V·s－1内进行扫描，改变扫描速率，考察荧光素峰电流（Ip）及峰电位（Ep）随扫描速率的变化关系。结果表明：峰电流与扫描速率（v）呈正比，线性回归方程为Ip（×10－2nA）＝14.43 v（V·s－1）＋4.586，相关系数为0.992 0。说明该电极反应受吸附控制。

Ep随v的增大而负移，Ep与lnv呈线性关系，其线性回归方程为Ep（V）＝－0.027 1lnv－0.857，相关系数为0.997 8。

当反应体系为受吸附控制的不可逆体系时，符合 Laviron′s公式［16］：

式中：E0为标准电极电位，V；R为热力学常数，8.314J·mol－1·K－1；T 为热力学温度，K；α为电子转移系数；n为电极反应中电子转移数；F为法拉第常数，96 485C·mol－1；ks为表面反应标准速率常数；v为扫描速率，V·s－1。

Ep和lnν呈线性关系，进一步说明荧光素在pH 6.5的B－R缓冲溶液中在滴汞电极上发生了由吸附控制的不可逆电极反应。由Laviron′s公式计算得 αn＝0.995 2；E0＝ －0.796 4V；ks＝0.106 9s－1。若α＝0.5，则n约等于2，故电极过程中有2个电子参加反应。

配制无三聚氰胺的荧光素溶液，在仪器工作条件下，于0.1～0.8V·s－1内改变扫描速率，考察荧光素峰电流及峰电位随扫描速率的变化关系。由Laviron′s 公 式 计 算 得 αn＝0.943 0；E0＝－0.794 4V；ks＝0.108 2s－1。若α＝0.5，则n约等于2，可推测电极过程中有2个电子参加反应。

由此可见，加入三聚氰胺与否，体系的相关电化学参数基本相同，从而证明电极反应物为荧光素。

本工作建立了一种简易的间接测定乳制品中三聚氰胺的极谱法，线性范围宽，检出限低。并进行了荧光素的电化学行为研究，证明其极谱波为不可逆还原波，电极反应物是荧光素。方法用于乳制品中三聚氰胺的测定，结果满足分析要求。

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