固相萃取－毛细管区带电泳法同时测定豆制品中4种碱性染料

张 伟，陈 艳，何丰瑞

（西安市疾病预防控制中心，西安710054）

碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22和碱性嫩黄O都属于偶氮工业染料，主要用于腈纶、纺织品、纸张、皮革、家具等的染色［1］。这些染料具有致癌、致畸作用，对人体健康具有严重的危害。《中华人民共和国食品添加剂使用卫生标准》及《中华人民共和国食品卫生法》规定，禁止碱性橙作为食品添加剂。由于这些染料在中性及偏碱性的条件下与蛋白质吸附牢固，不易褪色，而且成本低廉，一些不法食品生产商使用这些染料对豆制品进行染色，使之色泽光亮，欺骗消费者［2］。

目前，豆制品中这几种碱性染料的测定方法有高效液相 色 谱 法［3－5］、液 相 色 谱－质 谱 法［6－7］、分 光 光度法［8］，我国食品中碱性染料的检测标准使用直接提取－高效液相色谱法，目前尚未见采用毛细管电泳法同时测定这几种碱性染料的文献报道。

毛细管电泳作为一种分离方法，具有绿色环保、仪器简单、分析快速、分离效率高等优点，在实际样品分析中应用越来越广泛。本工作采用乙酸铵溶液提取、固相萃取的前处理方法，建立毛细管区带电泳法同时测定碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22和碱性嫩黄O的分析方法，并应用于豆制品中碱性染料的测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

贝克曼P／ACE MDQ型毛细管电泳仪，配紫外检测器；Turbo Vap型自动浓缩仪；未涂层熔融石英毛细管柱（75μm×40cm，有效长度30cm）；Oasis HLB固相萃取柱。

标准储备溶液：1.000g·L－1，分别称取10.00mg的碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O，用水溶解后，定容至10mL，避光于4℃密封保存。使用时稀释至所需质量浓度。

磷酸二氢钾溶液：100mmol·L－1，称取磷酸二氢钾1.35g，用水溶解后，定容至100mL。

碱性橙2（纯度 99.6%）、碱性橙 21（纯度90.2%）、碱性橙22（纯度95.4%）、碱性嫩黄 O（纯度79.0%）标准品；甲醇、乙腈、氨水为色谱纯；乙酸铵、磷酸二氢钾为分析纯；试验用水为超纯水（电阻率为18.2MΩ·cm）。

1.2 电泳条件

分离电压20kV，分离温度30℃，检测波长210nm，进样方式为压力进样（0.13MPa，0.5s），运行缓冲溶液为含20%（体积分数，下同）乙腈的40mmol·L－1磷酸二氢钾溶液（pH 2.5）。每次进样前按水、甲醇、水的顺序清洗毛细管各1min，然后用运行缓冲溶液冲洗2min。

1.3 试验方法

将样品均质后，称取样品2.000g置于10mL具塞离心管中，加入50mmol·L－1乙酸铵溶液5.00mL，超声提取30min，以3 000r·min－1转速离心10min，将上清液取出置于离心管中，再加入50mmol·L－1乙酸铵溶液5.00mL提取一次，合并提取液后，以3 000r·min－1转速离心10min后收集上清液。含油样品加入正己烷2mL，涡旋振荡萃取，弃去正己烷层，重复3次，待过柱浓缩净化。

分别以甲醇3mL、水3mL活化HLB固相萃取小柱，将上述提取液5mL（用氨水调至近中性）加入萃取柱中，用3mL水淋洗后，加入氨水－乙腈（5＋95）混合液2mL洗脱，收集洗脱液。上样和洗脱过程流量控制低于1mL·min－1。将洗脱液于30℃用氮气吹至近干，加入乙腈－水（25＋75）溶液1.00mL，漩涡混匀30s后，过0.45μm 滤膜后待测。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

将碱性橙2、碱性橙21、碱性22、碱性橙O的标准储备溶液分别用水稀释成50mg·L－1。以水为空白，分别在190～800nm内对各标准溶液进行紫外－可见吸收光谱扫描，这4种碱性染料在450，210nm处均有较强吸收。由于食品样品基体复杂，在可见区域有较大干扰，并且由于仪器限制，不能在450nm处进行检测，试验选择210nm作为检测波长。

2.2 电泳条件的选择

2.2.1 缓冲试剂和缓冲溶液的酸度

缓冲试剂的选择主要由所需的酸度决定，而该酸度又因样品的性质和分离效率不同而不同［8－9］。在毛细管区带电泳中，待测物质在离子状态下才能实现分离。这4种碱性染料均有氨基基团，在酸性条件下可解离，因此试验选择磷酸、磷酸二氢钾作为分析的缓冲试剂。

缓冲溶液的酸度不仅能控制分析物的有效淌度，还控制着电渗流，同时对分析物的离子化程度有较大影响，因此是优化分离条件的重要因素。试验考察了不同酸度（pH 2.5，3.5，4.5，5.5，6.5）的40mmol·L－1磷酸二氢钾缓冲溶液对分离效果的影响，结果见图1。

由图1可知：随着缓冲溶液pH减小，出峰时间、峰高和峰面积均增加。在试验范围内，pH越小，4种碱性染料的分离效果越好。因此，试验选择缓冲溶液的pH为2.5。

2.2.2 缓冲溶液浓度

缓冲溶液浓度通过影响溶液的黏度和电渗流，进而影响样品的分离情况。一般情况下，缓冲溶液的浓度越高，电渗流越低，迁移时间就会延长，分离度增加。但是，缓冲溶液浓度的升高却会增加焦耳热，使峰形变宽，峰面积下降。试验分别考察了使用20，40，60，80mmol·L－1磷酸二氢钾溶液时，4种碱性染料的迁移时间和分离度。结果表明：随着磷酸二氢钾溶液浓度的升高，4种碱性染料分离度增加，但电流同时增加，迁移时间延长。综合考虑，试验选择40mmol·L－1磷酸二氢钾溶液。

2.2.3 添加剂的种类及其用量

运行缓冲溶液中添加有机溶剂，可以减少毛细管电泳的电渗流，降低焦耳热，从而有利于物质的分离。有机添加剂通常具有较高的偶极矩和介电常数，并对被测物质有良好的溶解性。一般来说，甲醇、乙腈是比较合适的有机添加剂。试验对比了不同有机溶剂（甲醇、乙醇、乙腈、丙酮）对4种碱性染料分离效果的影响。结果表明：添加甲醇、乙醇、丙酮使峰形拖尾，同时迁移时间也明显增加；而添加乙腈能够明显改善峰形，增加分离度。试验进一步比较了运行缓冲溶液中乙腈的体积分数对4种碱性橙分离效果的影响，结果见图2。

结果表明：随着乙腈体积分数的增加，峰形明显改善，分离度增加，迁移时间减少。但过多的乙腈容易在毛细管内形成气泡，造成基线波动，因此综合考虑分离效果和基线波动等因素，试验选择添加20%的乙腈。

2.2.4 分离电压和温度

试验比较了分离电压在15～30kV时对4种碱性染料的分离效果的影响。结果表明：随着分离电压的升高，迁移时间缩短，但基线噪声随之增大。试验选择分离电压为20kV。

图1 运行缓冲溶液酸度对4种碱性染料分离效果的影响Fig.1 Effect of acidity of the running buffer solution on the separation efficiency of the four basic dyes

图2 运行缓冲溶液中乙腈体积分数对4种碱性染料分离效果的影响Fig.2 Effect of the volume fraction of acetonitrile in the running buffer solution on the separation efficiency of the four basic dyes

图3 4种碱性染料混合标准溶液的电泳图Fig.3 Electrophorogram of mixed standard solution of the four basic dyes

毛细管的柱温对迁移时间、电渗流重现性都有一定的影响［10］。试验比较了分离温度分别为20，25，30，35℃时4种碱性染料的分离效果。结果发现：在分离温度为30℃时，4种碱性染料有较好的分离度并且迁移时间较短。

在最优条件下，混合标准溶液的电泳图见图3。

2.3 样品前处理条件的选择

2.3.1 提取液

文献［10－14］中报道用于提取这4种碱性染料的溶液有乙酸－甲醇（1＋9）溶液、氨水－甲醇（1＋9）溶液、乙醇、乙醇（3＋7）溶液、乙酸铵溶液等。试验在空白豆腐皮样品中加入标准溶液，考察了以上提取液对4种碱性染料的提取效果。结果表明：50mmol·L－1乙酸铵溶液的提取率最高，同时便于下一步的浓缩净化过程。因此，试验选择50mmol·L－1乙酸铵溶液作为提取液。

2.3.2 固相萃取柱

在碱性染料净化的固相萃取柱的选择上，HLB柱［15］、C18柱［7］、MCX 柱［16］均有文献报道。试验考察了这3种固相萃取柱的净化效果，结果表明：MCX固相萃取柱与碱性橙的结合能力很强，必须使用二氯甲烷、三氯甲烷等溶剂才能洗脱，HLB固相萃取柱在杂质的去除和回收率上均优于C18固相萃取柱。因此，试验选择HLB作为固相萃取柱。

2.3.3 洗脱溶剂

试验考察了不同类型洗脱剂（氨水－甲醇溶液、氨水－乙腈溶液、氨水－丙酮溶液）的洗脱效果，结果表明：氨水－甲醇溶液的洗脱能力差，不能够将碱性嫩黄O完全洗脱下来；氨水－丙酮溶液洗脱能力太强，洗脱杂质多，不利于测定；氨水－乙腈溶液在保证将这4种碱性染料洗脱下来的前提下，洗脱的杂质少。试验选择氨水－乙腈溶液作为洗脱溶剂。

试验进一步考察了氨水－乙腈溶液中氨水的体积数（0，1.0%，2.5%，5.0%，7.5%）对洗脱效果的影响，结果见图4。

由图4可知：随着氨水体积分数的增加，碱性橙21、碱性橙22的回收率有明显上升；当氨水体积分数为5%时，4种碱性染料的回收率达到最高。试验选择5%的氨水－乙腈溶液作为洗脱溶剂。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

分别取标准储备溶液适量，配制5个浓度水平的标准溶液系列，在优化的电泳条件下，由低浓度到高浓度分别进样测定，从而得到4种碱性染料的线性回归方程以及线性相关系数，见表1。线性回归方程中y表示峰面积，x表示质量浓度。

将标准溶液按照不同的倍数稀释加入样品中，进行测定，分别根据3倍信噪比和10倍信噪比对应的样品中待测物质含量，确定方法的检出限（3S／N）和测定下限（10S／N），结果见表1。

图4 氨水的体积分数对洗脱效果的影响Fig.4 Effect of volume fraction of ammonia on the elution efficiency

表1 线性参数、检出限和测定下限Tab.1 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度与回收试验

取质量浓度为25mg·L－1的4种碱性染料的混合标准溶液，按试验方法进行测定，在一天内连续测定6次，以峰面积的相对标准偏差（RSD）考察方法的日内精密度，连续6d进行测定，考察方法的日间精密度，结果见表2。

取空白豆腐干样品，均质后称取12份，其中3份测定本底值，其余分别加入3个不同水平的混合标准溶液进行加标回收试验，每个水平测定3个平行样品，并计算峰面积的RSD，结果见表3。

表3表明：本法的加标回收率为7 3.6%～93.1%，能够满足分析的要求。

表2 精密度试验结果（n＝6）Tab.2 Results of test for precision（n＝6）

表3 回收试验结果（n＝3）Tab.3 Results of test for recovery（n＝3）

2.6 样品分析

应用本法测定腐竹和豆腐干等9种豆制品中的碱性染料，结果均未检出。图5为不同种类样品及其加标（20mg·kg－1）后的电泳图。

图5 空白样品与其加标后的电泳图Fig.5 Electrophorograms of blank samples before and after spiking with standard solution

［1］ 李娜，李晓丽，苗虹.食品中违禁色素检测方法的研究进展［J］.中国食品卫生杂志，2012，24（2）：185－189.

［2］ 林钦.高效液相色谱法同时测定豆制品中的碱性橙和碱性嫩黄 O染料［J］.色谱，2007，25（5）：776－777.

［3］ 朱浩，李小平，陈晓红，等.固相萃取－高效液相色谱法同时测定豆制品中的碱性嫩黄O、酸性橙Ⅱ和碱性橙Ⅱ［J］.分析试验室，2013，32（9）：63－67.

［4］ 高洁，尹峰，何国亮，等.高效液相色谱法测定豆制品中的碱性嫩黄 O［J］.分析试验室，2008，27（增1）：230－232.

［5］ 林黛琴，万承波，邱萍，等.液相色谱－串联质谱法快速测定食品中4种黄色工业染料［J］.质谱学报，2013，34（3）：170－178.

［6］ 郑小严.超高效液相色谱－串联质谱法同时测定食品中碱性橙、碱性嫩黄O和碱性桃红T［J］.分析科学学报，2009，25（4）：409－413.

［7］ 王建伟，钟海娟，梁炽琼.固相萃取－超高效液相色谱串联质谱法测定食品中碱性橙、碱性嫩黄O［J］.分析测试技术与仪器，2010，16（2）：108－112.

［8］ 李小燕，仝海娟，石展望，等.固相萃取－分光光度法快速检测腐竹中的碱性橙［J］.食品工业科技，2011，32（11）：477－450.

［9］ 陈义.毛细管电泳技术及应用［M］.北京：化学工业出版社，2006.

［10］ LAMBERT W J，MIDDLETON D L.pH hysteresis effect with silica capillaries in capillary zone electrophoresis［J］.Anal Chem，1990，62（15）：1585－1587.

［11］ GRUSHKA E，MCCORMICK R M，KIRKLAND J J，et al.Effect of temperature gradients on the efficiency of capillary zone electrophoresis separations［J］.Anal Chem，1989，61（3）：241－246.

［12］ 夏立娅，匡林鹤，吴广臣.改进的高效液相色谱梯度洗脱测定食品中碱性橙含量［J］.食品工业科技，2009，45（1）：304－306.

［13］ 张玉，王伟，徐丽红，等.高效液相色谱法同步测定食品中5种色素含量［J］.浙江农业科学，2012，53（3）：377－379.

［14］ 曹鹏，乔旭光，娄喜山，等.固相萃取结合超高效液相色谱－串联质谱法同时检测食品中的6种工业染料［J］.分析化学，2011，39（11）：1670－1675.

［15］ 赵榕，赵海燕，李兵，等.建立同时测定调味品中非法添加的4种工业染料的SPE－UPLC－MS／MS法研究［J］.中国食品卫生杂志，2009，21（5）：410－414.

［16］ 殷耀，丁涛，柳菡，等.固相萃取－高效液相色谱－串联质谱法测定辣椒中碱性橙类染色剂［J］.分析试验室，2014，33（3）：364－368.