结核分枝杆菌耐药机制和检测方法的研究进展

宋婧 车南颖

[摘要] 本文综述了结核分枝杆菌（MTB）的耐药机制和检测方法。耐药机制分为细胞壁渗透性降低及外排泵作用的固有性耐药机制和靶基因突变的获得性耐药机制。隨着分子生物学技术的发展，药物作用的靶基因突变被认为是MTB耐药的主要机制。耐药的检测方法主要为表型药敏检测和分子药敏检测。表型检测方法为金标准，但检测周期较长，而基因突变检测可以在几个小时内完成，在结核病的诊断中有更好的应用前景。本文对MTB的耐药机制和检测方法进行综述，以期为开发快速分子诊断工具和抗结核新药的研发提供参考或借鉴。

[关键词] 结核分枝杆菌；耐药；检测方法

[中图分类号] R378.91 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（b）-0029-06

[Abstract] This article reviews the mechanism and detection methods of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis（MTB）. The mechanism of drug resistance is divided into intrinsic resistance mechanism of cell wall permeability reduction and efflux pump action and acquired resistance mechanism of target gene mutation. With the development of molecular biology techniques， mutations in target genes are considered to be the main mechanism of drug resistance for MTB. The main detection methods for drug resistance are phenotypic susceptibility testing and molecular susceptibility testing. The phenotypic assay method is used as the golden standard， but the detection period is long， while gene mutation detection can be completed within a few hours， so there is a better application prospect in the diagnosis of tuberculosis. In this paper， the mechanism and detection methods of drug resistance in MTB are reviewed in order to provide some reference for the development of rapid molecular diagnostic tools and anti-tuberculosis drugs.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Drug resistance； Detection method

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所致的慢性传染病。尽管近年来TB的防治取得了进展，但其仍然是全球十大死因之一。根据2017年WHO最新报告，2016年全球估计有1040万TB新发病例[1]。中国TB新发病例在90万左右，新发耐药TB患者约5.8万人，且大部分患者未被发现或未接受治疗，我国TB的形势依然严峻，而MTB的耐药是治疗TB亟待解决的难题之一。目前部分阐明的MTB的耐药机制分为固有性耐药机制和获得性耐药机制，且药物作用的靶基因突变的获得性分子耐药机制是MTB耐药的主要机制[2]。MTB耐药性的检测方法分为表型药敏试验和耐药基因突变检测两种方法。本文对MTB耐药机制和检测方法进行了综述与展望。

1 MTB耐药机制

1.1 固有性耐药机制

1.1.1 MTB细胞壁渗透性障碍 细胞壁渗透性障碍，是MTB对常见的非抗结核抗生素产生耐药的原因之一。MTB细胞壁的脂质含量非常高，对亲水性抗生素的渗透性非常低，这一物理屏障特性保护其免受有毒化合物影响。分枝杆菌的细胞壁由3个主要成分组成：肽聚糖（peptidoglycan，PG），阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan，AG）和分枝菌酸（mycolic acids，MA）[3]。青霉素结合蛋白（penicillin-binding proteins，PBPs）是参与细菌细胞壁肽聚糖生物合成的酶，在多数细菌中，β-内酰胺类抗生素灭活PBPs必需的D-D转肽酶从而杀灭细菌，有研究发现MTB具有第二类转肽酶，即L-D转肽酶，导致MTB对β-内酰胺类抗生素产生耐药[4]。亲水性抗生素通常利用通道蛋白穿过细菌外膜，有研究表明编码细胞壁通道蛋白的MspA基因突变引起的通道蛋白的丢失可能导致MTB对链霉素耐药[5]。

1.1.2 MTB药物外排泵（EPs） EPs是一种膜蛋白，MTB可以通过EPs排出进入细菌的药物，使药物浓度降低产生耐药。目前已经鉴定了分枝杆菌中的几种药物EPs，分别属于以下5个结构家族：主要异化子超家族（MFS）、小多重耐药家族（SMR）、耐结节细胞分裂超家族（RND）、ATP结合盒超家族（ABC）和多药及毒性化合物外排家族（MATE）。以MTB中MFS泵的研究为例：Rv2459（jefA）基因的转录增加导致对异烟肼（Isoniazid，INH）和乙胺丁醇（Ethambutol，EMB）的耐药性增加[6]。有研究表明，EPs可能在那些没有INH和利福平（Rifampin，RIF）耐药相关的基因突变的耐药MTB菌株中发挥重要作用[7]。

1.1.3 MTB中的双组分系统（two component systems，TCS） TCS由组氨酸激酶和反应调节子两部分组成，调节细菌的生理过程和代谢过程，在细菌的毒力及致病性方面发挥重要作用。休眠转录调节因子（DosR）是MTB中已被鉴定的TCS，其被诱导以适应缺氧等多种应激反应。MTB中的DosR、mbtB和hspX被报道参与从休眠到药物耐受的各种过程[8]。Nandakumar等[9]的研究表明，用INH处理野生型的MTB可引起DosR基因的表达增加。MTB TCS与耐药的关系仍需进一步研究。

1.2 获得性耐药机制

1.2.1 一线抗结核药物的获得性耐药 RIF是最主要的一线抗结核的药物，其作用机制是通过与RNA聚合酶β亚基结合，抑制细菌转录导致细菌死亡。超过95%的耐药菌株在编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因的81 bp（编码密码子507～533）利福平耐药决定区（rifampin resistance determing region，RRDR）中具有突变，导致RIF不能与RNA聚合酶β亚基结合引起耐药，常见的突变位点是Asp-516-Val、His-526-Tyr/Asp及Ser-531-Leu[10]。另外，有研究发现RRDR区外的突变，146、572、626位点突变与RIF耐药有关[11]。少数菌株RIF耐药与RNA聚合酶α、β亚单位的编码基因rpoA、rpoC突变相关，在非洲国家比较常见[12]。

INH是目前使用最广泛的一线抗结核药物，其作用机制较复杂。INH在过氧化氢酶-过氧化物酶的作用下转化为异烟酸，异烟酸代替烟酸结合NAD+，使得NAD+不能催化正常的氧化还原反应导致细菌死亡。KatG基因编码过氧化氢酶-过氧化物酶，它的突变导致INH不能转化为异烟酸，从而使MTB耐药。常见突变位点是Ser-315-Thr，占INH耐药菌株的70%～80%[13]。另一个常见突变是inhA启动子区-15C-T位点的突变，导致inhA的过度表达，常与低水平耐INH有关。katG S315T和inhA启动子-15C-T的两个突变可以解释超过80%的INH耐药病例[14]。目前发现没有KatG和inhA突变的INH耐药菌株可能与ahpC、kasA、fabG1和ndh基因的突变有关，例如ndh基因编码NADH脱氢酶，该基因突变导致NADH含量增加，干扰INH的过氧化作用，導致INH耐药[15]。但这些基因突变在INH耐药中的作用仍需进一步研究。

EMB是一种阿拉伯糖类似物，通过抑制阿拉伯糖基聚合入细胞壁中的阿拉伯半乳聚糖而干扰细胞壁的生物合成，导致细菌死亡。embCAB基因座（MTB中编码阿拉伯糖基转移酶）特别是embB基因的突变（Met-306-Val/Ile/Leu）是MTB中EMB耐药的主要原因，约占70%[16]。除embB外，embCAB基因座上其他基因突变也可导致EMB耐药。embC的突变频率仅次于embB，还有约15%的突变位于embC-embA基因区间[17]。

吡嗪酰胺（Pyrazinamide，PZA）作用于MTB菌体内，pncA基因编码的酰胺酶使PZA脱去酰胺基，转化为有活性的吡嗪酸而发挥杀菌作用。MTB pncA基因突变（Asp-12-Ala/Asn，Leu-85-Pro）导致PZA不能转化为吡嗪酸，是MTB对PZA耐药的主要机制，占68%～97%[18]。一些研究还发现rpsA（编码核糖体蛋白S1）、panD（编码天冬氨酸脱羧酶）和clpC1（编码ATP依赖性ATP酶）基因的突变也与PZA耐药有关[19]，但仍有待研究。

链霉素（Streptomycin，Sm）通过结合细菌核糖体的30S亚基抑制蛋白质合成，导致翻译过程中mRNA信息的错读而杀菌。Sm的作用靶点是核糖体30S亚基中的核糖体蛋白S12和16S rRNA，70%～95%的耐药是编码16S rRNA的rrs基因（A1401G，SNP）突变和编码核糖体蛋白S12的基因rpsL（Lis-43-Arg）突变所致[20]，因此已成为临床检测的主要耐药基因。

1.2.2 二线抗结核药物的获得性耐药 氨基糖苷类药物中的卡那霉素（Kanamycin，Kan）和阿米卡星（Amikacin，Amk）是治疗耐多药TB和广泛耐药TB的二线注射药物，其杀菌作用机制也是通过结合细菌核糖体的30S亚基而抑制细菌蛋白质合成。rrs基因（A1401G）突变导致Kan和Amk的高水平耐药性，占30%～90%[21]。有研究发现Kan耐药菌株中存在eis启动子区域的点突变或whiB7中5'端非翻译区的突变，但确切机制还有待证实[22]。在Kan、Amk、卷曲霉素和紫霉素（Viomycin，Vim）之间存在各种交叉耐药[23]。

氟喹诺酮类（莫西沙星、左氧氟沙星、环丙沙星）药物作用于两种必需的细菌拓扑异构酶，DNA促旋酶（也称为拓扑异构酶Ⅱ）和DNA拓扑异构酶Ⅳ使细菌不能正常复制和转录进而杀死细菌。MTB中的DNA促旋酶是由gyrA和gyrB基因编码的2个A亚基和2个B亚基组成的四聚体。氟喹诺酮耐药与gyrA（Ala-90-Val、Asp-94-Gly/Tyr）和gyrB（Asn-533-Thr）的喹诺酮耐药决定区域（QRDR）的突变有关[24]。

D-环丝氨酸（D-Cycloserine，Dcs）是D-丙氨酸的一种类似物，通过抑制MTB的alr和ddl两种酶，进而抑制细菌细胞壁肽聚糖的形成，减少其耐酸能力而起到杀菌及抑菌的作用。cycA属于氨基酸转运家族，负责D-丙氨酸、D-丝氨酸的运输，参与环丝氨酸的正常吸收。alrA基因和cycA基因的突变可能是MTB D-环丝氨酸耐药机制之一[25]。

利奈唑胺是一种恶唑烷酮类抗生素，通过与细菌50S亚基核糖体RNA的23S位点结合，抑制细菌蛋白质合成。在一项有39例患者的研究中，34例在利奈唑胺治疗的6个月内实现了培养转阴，除出现周围神经病变和骨髓抑制的副作用外，还出现了血小板减少症和视神经炎的严重副作用[26]。利奈唑胺使用受限于严重的药物毒性。目前，在耐利奈唑胺MTB临床分离株中检测到rplC基因和rrl基因的突变[27]。

氯法齐明（clofazimine，Cfz）是WHO推荐的新的短期耐多药治疗方案的组成部分[28]。其杀菌机制可能与Cfz氧化还原循环产生活性氧类物质有关。最新一项研究发现，氯法齐明-贝达喹啉交叉耐药菌株均在转录调节因子Rv0678基因中有突变。该突变导致EPs MmpL5的表达上调，产生对Cfz和贝达喹啉的交叉抗性。在Cfz敏感菌株中不存在Rv0678突变，无Rv0678突变的Cfz耐药菌株在Rv1979c中具有A155C突变[29]。

贝达喹啉（Bedaquiline）是40多年来第一种以新机制上市的抗结核药物。是用于耐多药TB的二芳基喹啉药物，结合并抑制由atpE编码的分枝杆菌ATP合酶阻止MTB利用ATP导致细菌死亡。贝达喹啉耐药菌株的atpE基因的突变通常在Ala-63-Pro及Ile-66-Met。没有atpE突变的耐贝达喹啉菌株中存在Rv0678的突变，常常与Cfz产生交叉耐药[30]。

2 MTB耐药检测的主要方法

2.1 表型检测方法

2.1.1 传统药物敏感性检测（drug susceptibility testing，DST） DST是多药耐药（multidrug resistance，MDR）-TB检测的金标准，常用于实验室内质量控制和室间质评，常用的有绝对浓度法、抑制率法和琼脂比例法三种。绝对浓度法和抑制率法是计算含梯度浓度药物培养基上最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的方法，以此反映MTB对药物的敏感性。琼脂比例法是将MTB接种在不含药物和含有临界值浓度药物的培养基上，观察菌株生长情况。比例法较前两种方法操作繁琐，且只能定性。无论哪种DST实验，均存在检测周期长、耗时费力等缺点，不能满足临床快速诊断的需要。

2.1.2 显微镜观察药物敏感性检测（microscopic observation of drug susceptibility，MODS）技术 MODS技术的原理是将标本接种在含抗结核药的液体培养基中培养，MTB生长会表达索状因子，使细菌聚集呈条索状结构。若无此结构，表明MTB对该药物敏感。通过显微镜下对特征性索状结构的观测，来确定有无MTB生长及其对药物的敏感状态。该法将检测周期缩短至1周，且有研究表明此法的敏感性和特异性较高[31]，成本低，操作安全。但因对检测人员的要求较高限制了其在临床的广泛应用。

2.1.3 基于MTB代谢反应的检测方法 BACTEC MGIT960是目前常用的快速MTB培养及药敏鉴定的生长指示管系统，其将感应到的MTB生长时氧气量的变化，转化为荧光信号被探测器监测。检测周期平均缩短至5～8 d，自动化程度较高、污染率低，可用于该系统的标本来源广，因此WHO批准其为MTB耐药性检测的推荐方法[32]。

此外，硝酸还原酶试验（NRA）和氧化还原指示剂试验（CRI）试验也是利用细菌生化代谢反应进行药敏鉴定的方法。在加入抗结核药物的培养基中观察MTB与指示剂反应后的颜色变化，判断对该药物敏感性[33]。两种方法检测周期均在7～10 d，但因操作步骤没有完全标准化，且少数结核菌种并不具备上述代谢反应使该法未被广泛使用。

2.2 基因检测方法

2.2.1 GeneXpert MTB/RIF和Xpert MTB/RIF Ultra GeneXpert MTB/RIF是由Cepheid 公司开发的以实时荧光定量PCR技术为基础，rpoB基因为靶基因，系统自动运行并同时检测标本中是否含有MTB，RIF是否耐药的诊断平台，其减少了人为操作误差，且检测周期只需要2 h，是目前WHO推荐用于检测RIF耐药的方法。李妍等[34]的研究显示痰标本的Xpert MTB/RIF敏感度最高可达97.5%，特异度为95%～99%，对肺外结核诊断也有一定的价值。此方法的缺点是检测不到少数突变发生在RRDR序列以外的RIF耐药菌株。另外，当检测涂片阴性的痰标本和含有较低水平MTB的肺外组织标本时，其灵敏度稍差。由Cepheid开发的新的Xpert MTB/RIF Ultra试剂盒与现有的Xpert MTB/RIF相比有了更好的灵敏度，将PCR反应中纯化DNA的数量加倍，添加了针对IS6110和IS1081的实时荧光定量TB检测探针，并结合探针熔解曲线的双链DNA熔点（Tm值）进行分析。最新的研究显示TB阳性痰标本Xpert MTB/RIF Ultra检出的灵敏度比Xpert大约提高了8倍[35]。Bahr等[36]的研究报道Xpert MTB/RIF Ultra检测疑诊或确诊结核性脑膜炎的患者脑脊液标本的敏感性为70%，Xpert MTB/RIF为43%，细菌培养法也为43%。WHO推荐使用Xpert MTB/RIF Ultra作为疑似结核性脑膜炎的初步诊断测试。

2.2.2 实时荧光定量探针熔解曲线 在PCR体系中加入两端分别标有荧光基团和淬灭基团的探针，根据探针与标本中不同的靶序列杂交后形成的双链DNA Tm值的差异可推断靶序列的突变信息。如果靶序列与探针完全匹配，则探针与该序列杂交的Tm值最高，如果序列发生点突变、插入或缺失，则探针与该序列杂交的Tm值低于完全匹配的Tm值，即有耐药突变的发生。相关研究表明荧光定量PCR探针熔解曲线法和表型药敏试验检测RIF、INH耐药结果具有较高的一致性，临床上荧光定量PCR探针熔解曲线法可用于INH、RIF、EMB、Sm、喹诺酮类等药物的耐药基因检测[37-38]。

2.2.3 线性探针技术（line probe assays，LPA） LPA又称固相杂交分析，MTB DNA扩增产物与预先固化在试纸条上的特异性探针杂交，通过显色反应来判定耐药相关基因突变[39]。商品化线性探针技术主要包括GenoType MTBDRplus和INNO-LiPA Rif.TB两种试剂盒[40]。由德国Hain公司推出的GenoType MTB-DRplus耐多药检测试剂盒，可同时检测RIF（rpoB）和INH（katG、inhA）的耐药性，且研究表明，该技术无论对痰涂阳性还是痰涂阴性标本的RIF、INH耐药检测均有较高灵敏度和特异性[41]。比利时Innogenetics公司INNO-LiPA Rif.TB试剂盒也可检测RIF的rpoB基因突变。这两种试剂盒检测周期短，但检测结果需人工判断，操作流程复杂，且检测位点少，不能完全检出广泛耐药TB。

2.2.4 基因芯片 基因芯片技術的原理是将MTB的DNA扩增产物与固定在芯片上的探针杂交，扫描芯片及判读结果，从而发现突变的耐药基因。基因芯片技术是一种快速、安全、高通量的检测手段，现已广泛应用于结核的菌种鉴定、耐药性检测及基因组比较分析等研究领域。有研究显示基因芯片技术诊断MDR-TB的灵敏度和特异度分别为64.62%和97.75%[42]。基因芯片不足之处在于样品的准备与标记繁琐，检测成本较高，相关检查设备昂贵。

2.2.5 DNA测序技术 DNA测序是指对MTB特定基因片段或全部基因组进行测序，然后与已知的标准株基因序列对比，发现耐药基因突变。目前，美国Illumina MiSeq和Ion Torrent半导体测序（Thermo Fisher Scientific）的二代测序技术（Next-generation sequencing，NGS）系统已被用于检测与MTB耐药相关的突变。Illumina测序的技术原理是采用可逆性末端边合成边测序反应，在碱基延伸过程中，根据4种不同的荧光信号确认碱基种类。Ion Torrent是利用掺入的脱氧核糖核苷酸（dNTP）聚合过程中释放H+离子，半导体芯片感应pH变化，每一步洗去未结合的dNTP进行测序[43]。NGS的快速发展，使MTB全基因组测序（WGS）越来越快速和准确，成本也不断降低，有利于发现TB新的耐药分子机制。更值得期待的是，利用鸟枪宏基因组学（SMS）从临床样本例如痰样本中直接测序进行快速耐药检测诊断，但少量的细菌基因组和人类脱氧核糖核酸的竞争不占优势，需要有针对性的方法专门捕捉MTB细胞或DNA[44]。由于存在对技术人员要求高、检测设备昂贵的问题，DNA测序难以在短期时间内广泛用于临床MDR-TB检测。

3 总结与展望

本文分别对MTB耐药机制和检测方法进行了综述，理解MTB的耐药机制有助于分子诊断工具的发展和抗结核新药的研发。目前MTB的耐药机制尚未完全研究清楚，虽然药物作用的靶基因突变的获得性耐药为主要机制，但表型耐药与基因突变耐药的关系仍需进一步研究。有些耐药菌不能用现有的耐药机制解释，仍存在尚未发现的耐药机制。MTB耐药异质性的问题需要进一步研究，了解耐药TB发生发展的过程，有助于建立更有效的治疗方案。在检测方法方面，临床诊断MTB的耐药性需要快速和准确，基因突变检测是目前诊断MTB耐药最快的方法，可以在几个小时内完成，它挑战了作为MTB耐药检测金标准的表型检测方法，在TB的诊断中有更好的应用前景。NGS技术可以更多地检测出耐药性相关的基因，未来需要对这些基因进一步研究补充评估以确定它们在耐药性中的作用。

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（收稿日期：2018-04-09 本文编辑：张瑜杰）