胃癌患者血清SALL4的水平及其对胃癌细胞迁移能力的影响

刘蕾 李砚 郭元彪

[摘要] 目的 研究SALL4在胃癌患者与健康人群血清中含量差异，并探讨SALL4分子在胃癌进展中的作用。 方法 选择2016年3月～2018年4月在成都市第三人民医院治疗的47例胃癌患者和参加体检的29例健康志愿者。采用酶联免疫吸附测定方法检测血清中SALL4含量；采用Real-time PCR和Western blot分析SALL4在多种胃癌细胞株和胃黏膜细胞株中的mRNA水平和蛋白水平表达情况；通过siRNA干扰研究SALL4对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响；Western blot分析上皮间质转化（EMT）相关分子表达情况。 结果 SALL4在胃癌患者血清中的含量显著高于健康志愿者，差异有高度统计学意义（P < 0.0001）。SALL4在多种胃癌细胞株中mRNA水平和蛋白水平的表达情况均高于胃黏膜细胞株。干扰SALL4表达后，胃癌细胞的迁移能力和侵袭能力均显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。SALL4表达降低可导致E-cadherin表达上调，snail、β-catenin和Wnt3a表达下调。 结论 SALL4与胃癌进展相关，可能通过诱导胃癌细胞EMT进程，促进细胞迁移和侵袭。

[关键词] SALL4；胃癌；细胞迁移；上皮间质转化

[中图分类号] R735.2；R73-37 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（b）-0009-05

[Abstract] Objective To investigate the difference of serum SALL4 levels between gastric cancer patients and healthy people， and to explore the role of SALL4 in the progression of gastric cancer. Methods A total of 47 patients with gastric cancer who were treated in the Third People′s Hospital of Chengdu from March 2016 to April 2018 and 29 healthy volunteers who participated in the physical examination were selected. The serum levels of SALL4 were detected by ELISA. The expression of SALL4 in mRNA level and protein level in various gastric cancer cell lines and gastric mucosa cells were analyzed by Real-time PCR and Western blot respectively. The effects of SALL4 on the cell migration and invasion ability were analyzed by siRNA interference. The expression levels of related molecules of epithelial-mesenchymal transition （EMT） were detected by Western blot. Results The serum SALL4 levels in patients with gastric cancer were significantly higher than those in healthy volunteers， and the difference was highly statistically significant （P < 0.0001）. The expression of SALL4 mRNA and protein in various gastric cancer cell lines was higher than that in gastric mucosal cell lines. The migration and invasion ability of gastric cancer cells were significantly decreased after interfering SALL4 expression， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Decreased expression of SALL4 leaded to the up-regulation of E-cadherin expression and the down-regulation of snail， β-catenin and Wnt3a. Conclusion SALL4 is related to the progression of gastric cancer. It may promote cell migration and invasion by inducing the EMT process in gastric cancer cells.

[Key words] SALL4； Gastric cancer； Cell migration； Epithelial-mesenchymal transition

胃癌是全球最常見的四大恶性肿瘤之一，超过50%的病例发生在亚洲东部。在亚洲，胃癌是继乳腺癌和肺癌后最常见的第三大恶性肿瘤，是继肺癌后第二常见的癌症死亡原因[1]。虽然近年来肿瘤综合治疗技术快速发展，但胃癌患者整体临床疗效并没有显著改善。淋巴结转移被认为是胃癌预后的关键指标[2]。探索胃癌转移的分子机制有望为胃癌临床治疗提供新的思路。人类婆罗双树样基因-4（sal-like protein 4，SALL4）是一种锌指蛋白转录因子，位于人类20号染色体q13，有4个外显子[3]。SALL4不仅在早期胚胎发育、维持胚胎干细胞多能性和自我更新方面发挥着重要的作用，而且与遗传性疾病、血液系统肿瘤、生殖细胞肿瘤等多种恶性肿瘤密切相关[4]。本研究通过检测SALL4在健康人群和胃癌患者血清中的水平，分析SALL4对胃癌细胞迁移能力的影响及相关分子机制，探索SALL4分子在胃癌发生与转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年3月～2018年4月在成都市第三人民医院（以下简称“我院”）治疗的47例胃癌患者，其中男35例，女12例；年龄28～81岁，平均（57.47±9.77）岁。选取同期在我院接受体检的29例健康志愿者作为对照，其中男18例，女11例；年龄24～71岁，平均（55.37±11.72）岁。诊断标准：采取胃镜和病理检查进行确诊为胃癌。纳人标准：①首次确诊；②进行本研究前未接受放化疗等相关治疗。排除标准：①合并其他类型肿瘤者；②有严重血液系统疾病、感染性疾病、心力衰竭、肿瘤病史以及重大手术史者；③就诊前服用过消炎、镇痛等药物者；④合并心、肝、肾等原发性疾病者；⑤临床资料不全者。胃癌患者与健康体检者的性别、年龄等基础资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 主要试剂

Trizol试剂购于Invitrogen公司（货号：15596026），反转录试剂盒购于TaKaRa公司（货号：RR047A），实时荧光定量PCR（Real-time PCR）试剂盒购于TaKaRa公司（货号：RR820A），蛋白裂解液RIPA购于上海碧云天生物技术有限公司（货号：P0013C），BCA法蛋白浓度测定试剂盒购于Thermo Scientific公司（货号：23227），一抗SALL4和Wnt3a购于abcam公司（货号：ab29112、ab28472），E-cadherin、snail、β-catenin和GAPDH购于CST公司（货号：3195、3879、8480和97166），电子学元件实验室（ECL）化学发光液购于Millipore公司（货号：WBKLS0100），细胞转染试剂购于QIAGEN公司（货号：301705）。

1.3 酶联免疫吸附测定（ELISA）

采用PerkinElmer公司全自动酶标仪，按照SALL4酶联免疫吸附测定试剂盒（Mybiosource公司，货号：MBS914458）说明书进行检测。

1.4 Real-time PCR

用Trizol试剂提取细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA。应用Roche公司定量PCR仪，采用SYBR Green法进行qPCR分析。以GADPH基因为内参，2-△△Ct法计算SALL4基因的相对表达量。SALL4基因上游引物序列：5′-TTTTACCACCAAAGGCAACT-3′，下游引物序列：5′-CACAACAGGGTCCACATTC-3′；GADPH上游引物序列：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.5 免疫印迹（Western blot）

用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳。80 V转膜3 h，脱脂牛奶室温封闭2 h，4℃孵育相应的一抗过夜。洗涤缓冲液（TBST）清洗后加入对应的二抗，室温孵育2 h；TBST清洗后加入ECL化学发光液，暗室中显影。

1.6 细胞转染

按照转染试剂说明书，用siRNA-SALL4（sense：5′-GCUAGACACAUCCAAGAAATT-3′，anti-sense：5′-UUUCUUGGAUGUGUCUAGCTT-3′）及阴性对照siRNA-NC（sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，anti-sense：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′）转染胃癌细胞系AGS，通过实时荧光定量PCR和免疫印迹检测，验证SALL4基因的干扰效率，用于后续实验。

1.7 细胞迁移和侵袭实验

采用划痕实验评估细胞的迁移能力。将转染siRNA-SALL4和siRNA-NC的細胞分别接种于6孔板中，待细胞铺满培养板后，用200 μL枪头垂直画线，PBS清洗3次，加入含有2%血清的培养基，显微镜下拍照。置于培养箱中培养24 h后再次拍照。测量两组细胞划痕宽度并计算相对迁移率。

采用Transwell实验评估胃癌细胞的侵袭能力。将转染siRNA-SALL4和siRNA-NC（对照组）的细胞分别重悬于无血清培养基中，置于含有Matrigel的上室内，在下室中加入含有30%血清的培养基，诱导培养24 h后取出小室，用棉签擦拭掉上室细胞，甲醇固定，结晶紫染色，置于显微镜下拍照并计数。

1.8 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌患者及健康志愿者血清中SALL4的含量

ELISA检测结果显示，胃癌患者血清中SALL4的浓度为（286.55±31.28）pg/mL，对照血清中SALL4的浓度为（28.36±3.46）pg/mL，胃癌患者血清中SALL4的含量显著高于健康志愿者，差异有统计学意义（P < 0.0001）。见图1。

2.2 胃癌细胞中SALL4表达情况

Real-time PCR检测结果显示，与胃黏膜细胞株GES-1比较，SALL4分子在胃癌细胞株AGS中的mRNA水平显著升高（P = 0.0472），在胃癌细胞株BGC-823、MGC-803和SGC-7901中的mRNA水平也呈增高趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05）。Western blot检测结果也显示SALL4分子在上述胃癌细胞株中的蛋白表达水平高于胃黏膜细胞株。见图2。

2.3 siRNA对胃癌细胞中SALL4的干扰情况

胃癌细胞AGS中分别转染siRNA-NC和siRNA-SALL4，Real-time PCR检测干扰效率。结果显示，AGS-siSALL4细胞中SALL4的mRNA水平顯著低于siRNA-NC（P = 0.0401）；Western blot验证蛋白水平的干扰效率也获得一致的结果，提示可以用于后续实验。见图3。

2.4 SALL4对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响

划痕实验结果显示，与对照组比较，干扰SALL4表达可显著降低胃癌细胞的相对迁移率（P = 0.0367）。Transwell实验结果显示，SALL4表达降低导致胃癌细胞侵袭能力显著降低（P = 0.0463）。提示SALL4可促进胃癌细胞迁移和侵袭能力。见图4。

2.5 SALL4促进胃癌细胞迁移和侵袭的分子机制

Western blot检测结果显示，与对照组比较，SALL4表达下调可影响上皮间质转化（EMT）进程相关分子的表达水平，即E-cadherin表达上调，snail、β-catenin和Wnt3a表达下调。提示SALL4可能通过诱导胃癌细胞EMT进程促进细胞迁移和侵袭。见图5。

3 讨论

癌细胞与胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）有许多相似之处。ESCs基因在大多数成熟的组织器官中表达缺失，这些基因可能是癌症特异性诊断和治疗的理想候选靶点。SALL4是能够建立ESCs与癌细胞相互联系的少数基因之一[5]。胚胎发育早期，SALL4在维持ESCs的多能性和自我更新方面起着至关重要的作用[6-7]；出生后，随着组织器官成熟，SALL4表达逐渐降低。然而，最新研究发现，SALL4在多种恶性肿瘤中被重新表达。

SALL4表达情况和表观遗传状态的分析表明，SALL4在多种肿瘤中异常表达，如肺癌[8]、乳腺癌[9-10]、子宫内膜癌[11-12]、结肠癌[13]、胃癌[14-16]、肝细胞癌[17]、胶质瘤[18]等。上述研究提示，SALL4可以作为肿瘤诊断和预后评估的分子标志物。然而，这些研究部分关注SALL4的RNA表达水平，部分关注蛋白质表达水平。即使是对于SALL4蛋白免疫组化的研究，也因使用不同的抗体而产生不同的诊断标准。因此，将SALL4发展为肿瘤诊断和预后评估的标志物还面临较大挑战。本研究采用ELISA检测胃癌患者血清中SALL4分子的浓度，发现胃癌患者血清中SALL4的表达显著高于健康志愿者。这为将SALL4开发成血清肿瘤标志物提供了依据。

SALL4分子在癌症的发生和进展过程中起着多方面的作用，如调节细胞的增殖、凋亡、侵袭迁移、化疗抵抗和维持肿瘤干细胞特性等。进一步探索SALL4致癌作用的潜在分子机制有望将其开发为新的癌症治疗靶点。研究者发现，SALL4在多种肿瘤中异常表达与肿瘤转移密切相关。SALL4表达下调显著抑制了子宫内膜癌中癌细胞的体外迁移和侵袭特性以及体内转移潜能，这与SALL4特异性结合子宫内膜癌细胞中c-Myc基因启动子区相关[12]。SALL4表达与结直肠癌中淋巴结转移和Dukes分期呈正相关，其促进淋巴结转移的作用可能与β-catenin的相互作用有关[19]。SALL4抑制基底样乳腺癌中细胞间相互作用，导致细胞分散表型，促进肿瘤转移，其可能的机制是SALL4对EMT因子ZEB1具有正向调节作用，从而抑制E-cadherin的转录，导致细胞的分散和间充质基因的表达[20]。本研究发现，SALL4在多种胃癌细胞株中的表达均高于与胃黏膜细胞株；在高表达SALL4的AGS细胞中干扰其表达，可以显著降低胃癌细胞体外迁移和侵袭能力，相关分子机制可能是SALL4表达下调抑制经典的Wnt/β-catenin信号通路活性，从而抑制胃癌细胞EMT进程。

综上所述，本研究首次研究了SALL4分子在胃癌患者血清中的含量，为将SALL4开发成血清胃癌标志物提供了依据。细胞水平研究结果提示，SALL4促进胃癌细胞迁移和侵袭能力可能与激活Wnt/β-catenin信号通路并促进EMT进程相关，这为胃癌提供了新的治疗靶点。然而，其具体的分子机制需要进一步探索与证实。

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（收稿日期：2018-06-22 本文編辑：任 念）