黑色素微粒修饰阿霉素对甲状腺未分化癌细胞耐药性的影响

张余春 张青 杨昱 赵一璟 王昆 马向华

[摘要] 目的 探究黑色素微粒修饰阿霉素（DOX-MNPs）对甲状腺未分化癌细胞（ATC）耐药性的影响。 方法 合成多巴胺黑色素纳米粒（MNPs）并加载阿霉素（DOX），紫外-可见光谱法测定不同质量比下MNPs的载药效率和容量，透射电子显微镜（TEM）和Brookhaven Zeta PALS分析仪分析纳米颗粒的特性。不同浓度的游离DOX和DOX-MNPs（0、10、20、40、80、160 mg/L）作用于ATC药物敏感细胞株HTh74和耐药细胞株HTh74R，MTT法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞对DOX的摄取能力。 结果 DOX-MNPs的负载效率随DOX和MNPs质量比的增加而降低，当质量比为0.167∶1时，加载效果达到峰值93.45%，该质量比下得到的DOX-MNPs具有与MNPs相似的形态，动作电位和粒径分布分别为13.79 mV和（241.1±4.8）nm。在HTh74R细胞中，DOX-MNPs浓度高于20 mg/L时，细胞活力显著低于同等药物浓度游离DOX（P < 0.05），DOX-MNPs的摄取率明显高于游离DOX（P < 0.05），与HTh74细胞的摄取程度相似。 结论 在耐药HTh74R细胞中，DOX-MNPs的细胞摄取能力和治疗效果显著高于同等药物浓度下的游离DOX。

[关键词] 甲状腺未分化癌；耐药性；阿霉素；多巴胺黑色素纳米粒

[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（b）-0004-05

[Abstract] Objective To research the influence of Doxorubicin loaded melanin nanoparticles （DOX-MNPs） on drug resistance of anaplastic thyroid cancer （ATC） cells. Methods Dopamine-melanin nanoparticles （MNPs） were synthesized as previously reported and Doxorubicin （DOX） was loaded onto MNPs. The loading efficiency and capacity of MNPs at different mass ratios of DOX to MNPs were determined by UV-Vis spectroscopy and the characterization of nanoparticles was acquired by transmission electron microscopy （TEM） and Brookhaven Zeta PALS analyzer. HTh74 and HTh74R cells were incubated with various concentrations of free DOX and DOX-MNPs （0， 10， 20， 40， 80， 160 mg/L）. Cell viability was determined by MTT， and intracellular DOX fluorescent signal was determined by flow cytometry studies. Results The MNPs was successfully synthesized and the loading efficiency of DOX-MNPs decreased with the increasing mass ratio of DOX to MNPs. The loading efficacy peaked at 93.45% when the mass ratio was 0.167：1. At this mass ratio， the obtained DOX-MNPs had similar morphology to MNPs， and zeta potential and size distribution of DOX-MNPs were 13.79 mV and （241.1±4.8） nm. In HTh74R cells， when the concentration of DOX-MNPs was higher than 20 mg/L， the cell viability was significantly lower than that of the equivalent drug concentration （P < 0.05）， and the uptake rate of DOX-MNPs was significantly higher than that of free DOX （P < 0.05）. The degree of uptake was similar to that of HTh74 cells. Conclusion The cellular uptake capacity and therapeutic effect of the DOX-MNPs are significantly higher than those of free DOX at the same drug concentration in drug-resistant HTh74R cells.

[Key words] Anaplastic thyroid carcinoma； Drug resistance； Doxorubicin； Dopamine-melanin nanoparticles

甲狀腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）是死亡率最高的癌症之一[1-4]，该病的5年生存率低至7%[5]。ATC是一种高度恶性肿瘤，它的标准化治疗是阿霉素（Doxorubicin，DOX）化疗联合放疗[6]。然而，ATC细胞常对DOX产生耐药性，从而导致疗效不佳[7-8]。因此，克服细胞耐药性的问题对改善ATC预后十分重要。ATC产生耐药性的关键机制在于多药耐药基因1（multidrug-resistant 1，MDR1）转运体的表达[9]。MDR1转运体将DOX分子泵出细胞外，导致细胞内药物浓度降低，从而影响化疗效果[7，10]。许多研究将纳米微粒作为药物载体以克服肿瘤细胞耐药性的问题[11-12]。纳米微粒通过增加细胞摄取或者抑制药物流出，能够高效运输药物并增加细胞内药物浓度。已经有研究报道将纳米微粒作为增强ATC疗效的药物的转运体，如脂质体[13]和纳米探针[14]，证实了纳米载体的可行性。然而，利用纳米微粒是否能改变ATC耐药性目前鲜见相关报道。本研究合成了负载阿霉素分子的多巴胺黑色素纳米粒（dopamine-melanin nanoparticles，MNPs）。黑色素存在人体许多组织中，如皮肤、毛发、眼睛，具有极佳的生物相容性[15-18]；DOX分子能够通过静电作用和/或π子能堆积作用吸附在MNPs表面从而进入细胞中[19]。本研究分别在药物敏感性细胞株HTh74和耐药细胞株HTh74R两类ATC细胞中研究DOX-MNPs的细胞摄取情况及治疗效果。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

盐酸多巴胺、乙醇和MTT试剂购自Sigma公司；阿霉素、28%～30%浓度的氨水、二甲基亚砜（DMSO）购自阿拉丁试剂网。F-12培养基[1%MEM培养基（100×）、1%两性霉素、1%青霉素（500×）、1%链霉素（500×）、10%胎牛血清]；磷酸盐缓冲盐水（PBS）购自凯基生物公司；流式细胞仪（型号Guauasoft 6 L）购自美国Milipor公司；JEOL JEM-2100显微镜购自日本电子株式会社公司；PrimelMer-LAMBDA 35紫外可见分光光度计购自美国珀金埃尔默公司；Brookhaven Zeta PALS分析仪购自美国布鲁克海文仪器公司。

1.2 合成MNPs

MNPs合成方法与Li等[19]研究方法相同。即将8 mL乙醇和0.6 mL氨水与18 mL超纯水混合，30℃水浴中搅拌至少30 min。加入50 mg/mL盐酸多巴胺2 mL，继续搅拌24 h，10 000 r/min离心15 min，弃上清液，再次离心，离心3次。收集沉淀颗粒，并在1 mg/mL浓度的超纯水中再分散，以备进一步使用。

1.3 MNPs修饰DOX

在获得的MNPs表面加载DOX，将DOX（0.5 mg/mL）的溶液与上述的MNP悬浮液混合，其质量比为0.167∶1～2∶2（DOX∶MNPs）。将混合物在室温下搅拌24 h，然后进行2次离心（13 000 r/min 离心15 min）和再悬浮处理。紫外-可见光谱法测定上清液中游离DOX的含量，从而确定不同质量比（DOX∶MNPs）情况下MNPs的载药效率和容量。DOX-MNPs在超純水中再分散，以进一步使用。

1.4 纳米颗粒的特性描述

使用JEOL JEM-2100显微镜获得MNPs的透射电子显微镜（transmission electronmicroscopy，TEM）图像。用PrimelMer-LAMBDA 35紫外可见分光光度计测定MNPs的紫外-可见光谱。使用Brookhaven Zeta PALS分析仪测量纳米颗粒的尺寸和动作电位。

1.5 MTT试验

敏感性细胞株HTh74和耐药细胞株HTh74R在5%CO2、37℃环境下的96孔板中培养24 h。随后将细胞与各种浓度的游离DOX（0、28、56、112、225、450 mg/L）、MNPs和DOX-MNPs（0、10、20、40、80、160 mg/L）一起孵育24 h。孵育后的细胞用冷PBS洗涤3次，用0.5 mg/mL MTT培养4 h，悬浮于DMSO中。酶标仪570 nm波长检测吸光度。

1.6 流式细胞分析

HTh74、HTh74R和HEK 293细胞株在5%CO2、37℃环境下的12孔板中培养24 h。随后用游离DOX（40 μg/mL）或与DOX浓度等效的DOX-MNPs孵育6 h。然后用冷PBS洗涤细胞3次，收集并再分散在PBS中，上流式仪检测。

1.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0统计学软件进行数据分析，两组细胞存活率比较采用t检验，以P < 0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 合成MNPs

根据上述方法成功合成MNPs。TEM图像显示获得的MNPs是直径（148.9±13.3）nm的纳米颗粒（图1）。流体动力学直径在（215.7±5.8）nm，比TEM图像中略大。动态光散射（dynamic light scattering，DLS）测量结果是（-25.3±3.2）mV负动作电位。

2.2 Dox-MNPs在不同质量比下的载药效率和载药容量

DOX-MNPs的负载效率随DOX和MNPs质量比的增加而降低（图2）。质量比为0.167∶1时，加载效果达到峰值93.45%。然而，DOX-MNPs的负载效率为12.64%～19.43%时，载药效率和载药容量与质量比的变化无关。

2.3 DOX-MNPs在不同质量比下的动作电位和流体动力学直径

DOX-MNPs的动作电位随着质量比的增加而降低（与质量比为0相比，P < 0.05）。质量比大于0.25时，获得的DOX-MNPs的动作电位从负向中性转变。随着动作电位的变化，DOX-MNPs的流体动力学直径随质量比的增加而增大。见图3。

DOX与MNPs的质量比确定为0.167∶1。TEM图像表明，在该质量比下得到的DOX-MNPs具有与MNPs相似的形态（图4）。动态光散射测量显示，该质量比下，DOX-MNPs的动作电位和粒径分布分别为13.79 mV和（241.1±4.8）nm（图3）。

2.4 不同MNPs、DOX-MNPs浓度培养下的细胞活力比较

MTT试验表明，MNPs浓度<450 mg/L时无明显的细胞毒性（图5）。与游离DOX或DOX-MNPs孵育24 h后，HTh74细胞在同等浓度DOX下的存活率相似（图6）。相反，在HTh74R细胞中，DOX-MNPs浓度>20 mg/L时产生的治疗效果显著高于同等浓度的游离DOX（P < 0.05）。最高测试浓度下（160 mg/L），游离DOX孵育的HTh74R细胞的存活率为（72.3±6.5）%，而DOX-MNPs孵育的HTh74R细胞存活率减少至（34.6±5.4）%。

2.5 游离DOX/DOX-MNPs培养下ATC细胞对DOX的摄取能力比较

荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS）结果显示，HTh74细胞中游离DOX与DOX-MNPs的摄取程度相似（图7a）。当其与HTh74R细胞孵育时，游离DOX的摄取率低于与HTh74细胞孵育时的摄取率，而DOX-MNPs的摄取程度与其在HTh74细胞的摄取程度相似（图7b），HEK293细胞中游离DOX和DOX-MNPs的摄取程度相似（图8）。

3 讨论

本研究成功合成了负载阿霉素分子的多巴胺黑色素纳米粒，通过π-π堆叠和氢键相互作用，DOX分子可以通过附着在MNPs表面而进入细胞中发挥治疗作用。

药物负载成功的难点是确定合适的药物与载体质量比。纳米颗粒可以以最小的粒子间桥接，保持载药后的胶体稳定性[20]。DOX与MNPs的质量比为0.167∶1时，加载效果达到峰值；TEM图像提示，在该质量比下得到的DOX-MNPs具有与MNPs相似的形态。胶体稳定性对纳米粒子的生物医学应用至关重要，故后续的研究均采用了该质量比。

为了进一步评估MNP的生物相容性，本研究将HTh74细胞和HTh74R细胞与不同浓度的MNPs孵育以观察细胞毒性。研究結果显示，MNPs浓度<450 mg/L时无明显的细胞毒性。比较同等浓度的游离DOX和DOX-MNPs对两种ATC细胞活力的影响，发现DOX-MNPs未增强DOX对药物敏感ATC细胞的治疗效果，但能显著抑制HTh74R细胞的耐药性，提高治疗效果。

为进一步了解DOX-MNPs提高疗效的机制，本研究比较了HTh74和HTh74R细胞对游离DOX和DOX-MNPs的细胞摄取能力。研究结果显示，在HTh74R细胞中，游离DOX的摄取程率小于与HTh74细胞孵育时的摄取率，DOX-MNPs的摄取率明显高于游离DOX，与其在HTh74细胞中的摄取率相似。以上结果表明，HTh74R细胞的耐药性可能与DOX内化不良有关，DOX-MNPs在HTh74R细胞中比游离DOX能够更有效地内化，从而提高化疗效果。为排除DOX-MNPs在正常细胞中增加对DOX摄取的可能性，本研究测定了HEK 293细胞中游离DOX和DOX-MNPs的细胞摄取，发现MNP给药系统不会增强药物对正常细胞的毒性。

综上所述，本课题组合成了能够高效负载DOX（93.45%）的多巴胺黑色素纳米微粒。在耐药HTh74R细胞中，DOX负载的多巴胺黑色素纳米微粒的细胞摄取能力和治疗效果显著高于同等药物浓度下游离DOX。本研究证实了黑色素纳米微粒可以用来克服甲状腺未分化癌耐药问题。

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（收稿日期：2018-08-02 本文編辑：任 念）