siRNA干扰Rac1表达对人晶状体上皮细胞增殖和迁移能力的影响

孙国庆 唐建明

[摘要] 目的 研究Rac1对人晶状体上皮细胞SRA01/04增殖和迁移能力的影响，探究Rac1在后囊下混浊及囊袋皱缩综合征发生、发展过程中的作用。 方法 将SRA01/04细胞分为Mock组和siRac1组，构建Rac1相关siRNA并瞬时转染于siRac1组细胞中，Western blot检测Rac1蛋白表达的变化，CCK检测细胞生长周期的变化，流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡变化，Transwell检测Rac1对细胞迁移能力的影响。 结果 两组72 h时吸光度值均高于24 h（P < 0.05），siRac1组48、72 h时吸光度值均低于Mock组（P < 0.05）；与Mock组比较，siRac1组mRNA和蛋白相对表达量明显降低，G1期细胞所占百分率明显增高，S期细胞所占百分率明显降低，穿越基质膜的细胞数明显减少，差异均有统计学意义（P < 0.05）。F-actin染色结果显示，siRac1组细胞的伪足形成能力较Mock组减弱。 结论 Rac1可能通过调节晶状体上皮细胞的增殖能力和迁移能力，影响后囊下混浊及囊袋皱缩综合征的发生、发展。

[关键词] 后囊下混浊；囊袋皱缩综合征；Rac1；晶状体；上皮细胞

[中图分类号] R776.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（b）-0017-04

[Abstract] Objective To study the effect of Rac1 on the proliferation and migration of human lens epithelial cells SRA01/04， and to explore the role of Rac1 in the development and progression of posterior capsular opacities and capsular contraction syndrome. Methods SRA01/04 cells were divided into mock group and siRac1 group. Rac1-related siRNA was constructed and transiently transfected in siRac1 group cells. Western blot was used to detect the changes of Rac1 protein expression， CCK was used to detect the changes of cell growth cycle， flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis， Transwell was used to detect the effect of Rac1 on cell migration ability. Results The absorbance values of the two groups at 72 hours were higher than those at 24 hours （P < 0.05）， the absorbance values of siRac1 group at 48， 72 hours were lower than those of mock group （P < 0.05）. Compared with mock group， the relative expression of mRNA and protein in siRac1 group decreased significantly， the percentage of G1 phase cells increased significantly， while the percentage of S phase cells decreased significantly， the number of cells passing through the membrane reduced significantly， the differences were statistically significant （P < 0.05）. F-actin staining showed that the forming ability of pseudopodium in siRac1 group was significantly weaker than that of mock group. Conclusion Rac1 may affect the occurrence and development of posterior capsular opacities and capsular contraction syndrome through adjusting the proliferation and migration of lens epithelial cells.

[Key words] Posterior capsular opacities； Capsular contraction syndrome； Rac1； Lens； Epithelial cells

后囊下混濁（posterior capsular opacities，PCO）和囊袋皱缩综合征（capsular contraction syndrome，CCS）是白内障超声乳化术后常见并发症，其发生与发展均与白内障术后残留晶状体上皮细胞的增殖与迁移有关[1-2]。Rac1是Rho家族重要成员之一，有促进细胞迁移、抑制细胞凋亡的作用[3]。近年来有文献证实，Rac1可以促进大鼠视网膜新生血管的形成[4]，而且在人翼状胬肉也有表达[5]。但Rac1作用于晶状体上皮细胞的实验研究较少。我们在人晶状体上皮细胞SRA01/04中通过siRNA来干扰Rac1的表达以观察其对细胞增殖和迁移能力的影响，从而验证通过降低Rac1表达以降低PCO和CCS发生及进展的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养与分组 SRA01/04购自中国医学科学院肿瘤细胞库，培养液为添加10%胎牛血清（美国，Gibco）的DMEM培养基（中国，吉诺），置于37℃、5%CO2培养箱中培养。转染前1 d将处于对数生长期的SRA01/04细胞分为转染空白组（Mock组）和基因沉默组（siRac1组），以5×105个/孔的浓度分别接种于6孔板中，每孔均添加2 mL无抗生素培养基，确定细胞平铺均匀。

1.1.2 试剂与耗材 siRNA购自上海吉玛公司，siRac1正义序列为5′-GGGAUGAUAAAGACACGAUTT-3′，反义序列为5′-AUCGUGUCUUUAUCAUCCCTT-3′；OPTI-MEMI（中国，吉诺）；Lipofectamin 2000（美国，Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染 将1 OD siRac1加入150 μL DEPC水中，溶解后混合均匀配置成20 nmol/L的siRac1溶液。将5 μL Lipofectamin 2000和5 μL siRac1加入250 μL OPTI-MEMI中孵育20 min后转入培养基已更换为OPTI-MEMI的6孔板中，每孔培养液总体积为2 mL。6 h后更换为完全培养基。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖能力 将转染后细胞弃去培养基后胰酶消化，调整细胞数为5×104个/mL接种于96孔培养板。每孔加入100 μL细胞悬液，另设不加细胞的培养基为本底。分别培养24、48、72、96 h后，吸出培养基，每孔加入含10% CCK-8的普通培养基110 μL，37℃下孵育2 h。在Safire荧光酶标仪（美国，TECAN）490 nm波长处测量各孔的吸光度值。吸光度值大小表示细胞增殖能力的强弱。实验重复3次。

1.2.3 Western blot检测蛋白相对表达量 细胞转染48 h后抽提细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后各取50 μg总蛋白在SDS-PAGE胶中进行凝胶电泳后转印于PVDF膜，经Rac1一抗（美国，Abcam）孵育过夜，羊抗鼠二抗（美国，Santa cruz）室温孵育2 h后HRP发光显影。以GAPDH作为内参。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期及凋亡 细胞周期检测：将转染后细胞胰酶消化后收集至试管中，经PBS洗涤后于70%的冰乙醇中固定置于4℃过夜，次日用PBS反复洗涤2次，在RNase A浓度为100 μg/mL、PI浓度为5 μg/mL的溶液中室温避光孵育30 min。用FACSCalibur流式细胞仪（美国，BD）检测。细胞凋亡检测：Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡。转染后收集细胞并用PBS洗涤，离心后分别加入300 μL结合缓冲液，轻轻混匀细胞后再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光孵育0.5 h后用流式细胞仪检测。CellQuest软件进行PCNA表达分析，确定表达PCNA细胞占检测细胞的百分比，分析细胞增殖、周期及迁徙等。

1.2.5 细胞迁移能力检测 24孔Transwell小室进行迁移实验。细胞转染后24 h胰酶消化后调整浓度为2.5×106个/mL，各取200 μL置于上室，下室中加入含有10%胎牛血清的完全培养基，培养48 h，取出Transwell小室，用棉签擦去聚碳酸酯膜靠近内室一面的细胞，甲醛室温固定10 min，结晶紫染色30 min，清水洗3遍，显微镜下观察细胞，记数。

1.3 统计学方法

SPSS 19.0统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用独立样本t检验比较Mock组和siRac1组的差异，其中重复测量设计采用重复测量数据的方差分析，各时间点的组间差异比较行独立样本t检验，各组的时间差异两两比较，行LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRac1对SRA01/04细胞增殖能力的影响

重复测量数据方差分析结果显示，组别、时间以及组别×时间的交互作用差异均有统计学意义（均P < 0.05）。进一步组内两两比较结果显示，与24 h比较，siRac1组和Mock组72 h时吸光度值均升高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；组间比较结果显示，siRac1组48、72 h时吸光度值均低于Mock组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表1。

2.2 siRac1对SRA01/04細胞Rac1 mRNA及蛋白表达的影响

与Mock组比较[（86.16±10.21）%、（89.68±7.13）%]，siRac1组mRNA及蛋白相对表达量[（15.23±4.56）%、（17.63±4.17）%]均明显降低，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见图2。

2.3 siRac1对SRA01/04细胞周期的影响

与Mock组[（46.96±4.90）%]比较，siRac1组G1期细胞所占百分率[（62.43±5.40）%]明显升高，差异有统计学意义（t = 8.249，P = 0.001）；与Mock组[（41.10±4.70）%]比较，siRac1组S期细胞所占百分率[（21.07±3.90）%]明显降低，差异有统计学意义（t = 21.492，P = 0.000）。见图3。

2.4 siRac1对SRA01/04细胞迁移能力及细胞骨架的影响。

siRac1组穿越基质膜的细胞数[（75±6）个]明显少于Mock组[（135±5）个]，差异有统计学意义（t = 16.145，P = 0.000）。F-actin染色结果显示，siRac1组细胞的伪足形成能力较Mock组减弱。见图4。

3 讨论

现代白内障手术的发展，已经将白内障手术推入屈光手术的范畴。所有可能会影响术后视觉质量的并发症都会被每一个术者极力避免，其中包括PCO和CCS[6-7]。PCO即后发性白内障，是白内障摘除术后最常见的并发症之一，其发病原因为白内障术后残留的晶状体上皮细胞迁移至后囊膜，进而分化为成纤维细胞[8-9]。

CCS表现为撕囊面积和晶状体囊袋赤道部直径缩小、前囊膜混浊、人工晶状体偏心、倾斜或脱位。CCS发病率虽不及PCO，但其一旦发生不良后果将更加严重。CCS发病原因为白内障术后残存的晶状体上皮细胞纤维化，致前囊膜皱缩，严重者可致人工晶体脱位或脱入玻璃体，继而引发眼内炎[10-12]。

因此PCO与CCS的发生都与白内障术后晶状体后囊膜、赤道部和前囊膜下残余的上皮细胞增殖、迁移有着直接的关系。白内障手术医生通过控制撕囊大小、前囊膜、后囊膜抛光等手术技巧，可显著降低CCS及PCO的发生率[13-15]。但手术技巧的提高并不能完全避免PCO及CCS的发生，尤其是儿童先天性白内障[1]。因此，阻断晶状体上皮细胞的增殖、迁移成为避免PCO及CCS发生最直接、最根本的方法。

Rho家族蛋白可以通过多种途径参与和调节细胞的生长、凋亡和细胞周期的变化。Rac1是Rho家族小GTP酶之一，它在人体各组织中均有表达，已有文献证实其参与肿瘤细胞侵袭迁移和周期调节。Rac1生物功能的发挥依赖于两种活性形式间的转换，且其具有调节细胞骨架重组、影响细胞形体极化、促进细胞运动与迁移、抑制细胞凋亡的作用[16-17]。目前Rac1是各个学科广泛研究的热点。齐岩等[18]对Rac1在鼻咽癌组织中的表达及预后做了相关研究。解娜等[19]阐述了Rac1对结肠癌细胞增殖的影响。张斌等[20]阐述了Rac1在脑胶质瘤干细胞迁移和侵袭中的作用。

本研究通过siRNA来干扰SRA01/04中Rac1的表达，提示Rac1不仅影响晶状体上皮细胞的生长水平及增殖能力，还影响其细胞周期及迁移能力。由于血眼屏障的存在，人晶状体内无血管，白内障术后残存的晶状体上皮细胞直接暴露于房水中，其生长、繁殖营养完全依赖房水。这也使得残存的晶状体上皮细胞所处的细胞外环境相对稳定，且相对易于体外培养模拟。因此，虽然本研究为体外细胞实验，但其应用性及稳定性相对可靠。期待后续可以在动物实验中进行前房内注射siRac1阻断Rac1的表达，验证其阻止PCO与CCS发生及发展的作用。

[参考文献]

[1] 雷智.先天性白内障手术预防术后后囊混浊的研究[J].中华眼外伤职业眼病杂志，2013，35（6）：430-433. doi：10.3760/cma.j.issn.2095-1477.2013.06.009.

[2] 田甜，刘伟，季建.囊袋皱缩综合征的研究进展[J].中华眼科杂志，2013，49（1）：79-83. doi：10.3760/cma.j.issn.0412-4081.2013.01.022.

[3] 周嘉黎，张玉，师少军.Rac1的生物学作用及其调控机制研究进展[J].中国药师，2014，17（1）：146-149.

[4] 张雄泽，张美霞，马麟，等.Ras相关的C3肉毒毒素底物1的小发夹RNA干扰活性氧-核因子κB通路抑制小鼠视网膜新生血管生成[J].中华眼底病杂志，2010，26（3）：203-207. doi：10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2010.03.02.

[5] 顾秋艳，张连珊.人翼状胬肉中Rac1蛋白和基质金属蛋白酶-2的表达及临床意义[J].眼科新进展，2010，30（12）：1127-1130.

[6] 王蕾，徐国旭，娄慧，等.囊袋收缩综合征的研究进展[J].临床眼科杂志，2016，24（2）：189-191.

[7] 秦素英，兰芳，毋艳君，等.白内障超声乳化术后囊袋皱缩综合征病因分析[J].眼科新进展，2016，36（9）：873-876.

[8] 张亚琳，张宁，邹燕红，等.白内障术后晶状体后囊膜混浊及远期视力下降影响因素分析[J].眼科新进展，2012， 32（4）：347-350.

[9] 吴强，陆道炎，王丽天，等.体外培养的晶状体上皮细胞株的确定及生长、分化规律[J].眼科新进展，1999，19（4）：220-223. doi：10.3969/j.issn.1003-5141.1999.04.002.

[10] Nishi O，Nishi K. Intraocular lens encapsulation by shrinkage of the capsulorhexis opening [J]. J Cataract Refract Surg，1993，19（4）：544-545.

[11] Andjeli S1，Zupan G，Perov？觢ek D，et al. Human anterior lens capsule epithelial cell contractions [J]. Acta Ophthalmol，2010，89（9）：e645-e653.

[12] 缪娜，范玮.白内障术后晚期人工晶状体脱位的研究进展[J].西南国防医药，2016，26（10）：1219-1221.

[13] Hanson RJ，Rubinstein A，Sarangapani S，et al. Effect of lens epithelial cell aspiration on postoperative capsulorhexis contraction with the use of the AcrySof intraocular lens：randomized clinical trial [J]. J Cataract Refract Surg，2006，32（10）：1621-1626.

[14] 马伊，史建生，罗维彬.超声乳化术中前囊膜抛光预防后囊膜混浊的临床研究[J].眼科，2001，10（4）：207-209. doi：10.3969/j.issn.1004-4469.2001.04.004.

[15] 郑慧芬，张玲琳.后囊膜连续环形撕囊术在白内障手术中的应用价值[J].中国基层医药，2015，22（4）：592-593.

[16] 周嘉黎，张玉，师少军.Rac1的生物学作用及其调控机制研究进展[J].中国药师，2014，17（1）：146-149.

[17] 张军，马增翼，李淑莲，等.HSF4B通过上调RhoA和Rac1促进晶状体上皮细胞迁移[J].中国生物化学与分子生物学报，2013，29（4）：377-382.

[18] 齐岩，黄波，司晋源，等.Rac1和Cdc42在鼻咽癌组织中的表达及预后相關性研究[J].中国实验诊断学，2013， 17（9）：1594-1598. doi：10.3969/j.issn.1007-4287.2013.09.014.

[19] 解娜，黄幼生，罗志飞，等.RNAi沉默Rac1基因对结肠癌细胞增殖及裸鼠成瘤的影响[J].山东医药，2016，56（40）：1-4. doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.001.

[20] 张斌，杨学军，于圣平，等.Rac1在脑胶质瘤干细胞迁移和侵袭中的作用[J].中华神经医学杂志，2013，12（3）：221-225. doi：10.3760/cma.j.issn.1671-8925.2013.03.002.

（收稿日期：2018-04-20 本文编辑：张瑜杰）