齐墩果酸通过PPARγ调控人脐静脉内皮细胞抗氧化损伤作用

朱宝华 谷春景 刘凤莲 刘璐 任艳红

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种常见的心血管致死性疾病，成为所有心血管疾病中的主要危险因子。目前，AS被认为是一种与血管壁脂质沉积相关的，且由免疫介导的慢性炎症性疾病，它的发病机制极其复杂。低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）是AS发生发展过程中的一个主要危险分子，其在AS中的主要表现形式是氧化LDL（oxidative-LDL，ox-LDL）。ox-LDL不仅可导致内皮细胞损伤，还可促进内皮细胞凋亡的发生，增强内皮通透性，也能够促使单核细胞向内皮细胞发生迁移，加强其附着力，从而促使AS的发生发展[1-2]。因此，阻止血管内皮细胞的病变对治疗AS具有重要的临床价值。

齐墩果酸（oleanolic acid，OA）是属于五环三萜类化合物，以游离或者成苷的形式存在，其在食物、药用植物等多种植物中广泛存在。研究表明，OA具有抗氧化[3]、抗炎[4]以及抗AS[5]等多种生物学功能。本课题组已有的发现表明，OA对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）氧化损伤具有保护作用[6-7]。但是，OA的这种抗内皮细胞氧化损伤作用机制尚未明确，需要进一步探讨和研究。

过氧化物酶体增殖激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）是一种配体依赖的核转录因子，属于核受体超家族成员。PPARγ在血管壁内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞和泡沫细胞都有较高水平的表达[8]。在心血管系统中，PPARγ可通过抗炎作用，抑制血管平滑肌增殖迁移，保护血管内皮细胞，增加胆固醇的逆向转运等作用发挥抗AS效应[9]。基于PPARγ抗AS功能以及本小组的前期研究结果，认为PPARγ在OA的抗内皮细胞氧化损伤中扮演重要角色，并初步探讨PPARγ参与OA抗内皮细胞氧化损伤作用的分子机制。

材料与方法

一、试剂：齐墩果酸（OA，≥99%）购买于美国Sigma公司；DMEM培养基以及胎牛血清购买于美国Gibco公司；BCA蛋白定量试剂盒购买于上海碧云天公司；MTT购买于美国Sigma公司。SOD、GSH-Px、MDA检测试剂盒购自武汉优尔生公司；ROS试剂盒由上海碧云天公司提供；PPARγ抑制剂GW9662由美国Cayman公司提供；抗PPARγ单克隆抗体购自美国CST公司；羊抗鼠抗体购自美国Cell Signaling公司。

二、实验方法

1.实验分组：对照组，ox-LDL模型组，ox-LDL+OA（10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L）组，ox-LDL+OA（10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L）+GW9662，GW9662单独处理组。

2.细胞培养：将HUVECs（购买于中国科学院上海细胞库）按（密度）接种于培养瓶或者培养板中，加入适量含有10%胎牛血清DMEM培养基培养细胞，置于一定条件（37 ℃，5% CO2）的培养箱中进行培养。待细胞生长至70%～ 80%融合度，用胰酶消化细胞，并按1：3 ～ 5进行传代培养。

3. MTT实验：将处于对数生长期的HUVECs（5×103个/孔）均匀接种到96孔板中，放置于细胞培养箱中孵育。药物处理细胞结束后，向每孔中加入5 mg/ml的MTT（20 μl）试剂，置于培养箱中孵育4 h，去掉上清液，加入150 μl DMSO，37 ℃培养箱中孵育30 min，充分溶解结晶物，在波长为570 nm的条件下，用酶标仪检测每孔的吸光度（A）值。

4.脂质过氧化物检测：HUVECs的SOD、GSH以及MDA水平都是应用酶联免疫吸附试验法，其主要区别是微孔板包被的单克隆抗体不同。具体操作步骤参考试剂盒说明书。所有标准品、样本加入微孔板后，经孵育、洗涤、二抗孵育、洗涤、加入底物显色并终止，在波长为450 nm的条件下，用酶标仪测定样品A值，并建立标准曲线，计算出样品浓度。

细胞内ROS水平运用活性氧检测试剂盒，主要利用DCFH-DA荧光探针的强度来反应细胞内ROS的浓度。详细的操作步骤参考试剂盒说明书，最后，用流式细胞仪检测。

5. Western blot检测PPARγ蛋白的表达水平：药物处理细胞后，提取细胞蛋白进行，使用蛋白定量试剂盒测定各组蛋白浓度，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离细胞蛋白，应用湿转法将蛋白转印至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶对PVDF膜进行封闭，于4 ℃条件下过夜孵育一抗（PPARγ、β-actin），抗体稀释比例均为1：1 000。用TBST于摇床上洗涤PVDF膜3次，每次10 min。室温孵育二抗60 min。用TBST于摇床上洗涤PVDF膜3次，每次10 min。加入显色剂，用成像仪显影。

三、统计学分析方法

使用SPSS 20统计软件对数据进行统计分析，细胞存活率、SOD、GSH、MDA、ROS相对荧光强度以及PPARγ蛋白水平实验数据用±s表示，多组间比较使用单因素方差分析，组与组之间的比较采用两样本t检验，以P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、OA提高ox-LDL诱导的HUVECs细胞存活率结果

MTT检测结果显示，ox-LDL组的细胞存活率为（49.17±0.62）%，OA（10、20、40 μmol/L）预处理可显著减弱ox-LDL对HUVECs细胞存活率的降低，其存活率分别为（68.51±1.16）%、（82.64±0.73）%、（92.37±0.13）%，差异具有统计学意义（t= 24.35，26.18，35.17，P= 0.034，0.027，0.008）；且呈剂量依赖性关系，以上结果提示OA可拮抗ox-LDL诱导HUVECs细胞的细胞损伤（图1）。

图1 OA对ox-LDL抑制HUVECs细胞活力的影响

二、OA逆转ox-LDL诱导HUVECs的氧化损伤结果

本研究进一步探讨了OA对ox-LDL作用下HUVECs细胞的抗氧化物质SOD、GSH活性和氧化损伤相关指标ROS、MDA水平的影响。结果发现，ox-LDL组的细胞SOD、GSH、ROS和MDA水平，与ox-LDL+OA（10 μmol/L）组、ox-LDL+OA（20 μmol/L）组、ox-LDL+OA（40 μmol/L）组的细胞SOD、GSH、ROS和MDA水平比较，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。同时，本研究还发现，OA对ox-LDL诱导的HUVECs细胞SOD、GSH活性的降低和MDA、ROS水平的增加抑制作用呈剂量依赖关系。以上结果表明OA可抑制ox-LDL诱导HUVECs细胞SOD，GSH含量的降低以及ROS和MDA水平的增加（表1）。

三、OA减弱ox-LDL对HUVECsPPARγ蛋白的下调作用结果

基于PPARγ抗动脉粥样硬化作用，于是猜想OA抗ox-LDL氧化损伤作用是否与调控内皮细胞PPARγ的表达水平有关。因此，进一步检测预处理OA的情况下，ox-LDL作用下的HUVECs细胞中PPARγ蛋白水平是否有变化。Western blot结果显示，OA预处理能明显逆转ox-LDL诱导的PPARγ蛋白水平的降低，且随着浓度的增加，OA的这种逆转作用也不断提高。以上结果提示，OA可拮抗ox-LDL导致的HUVECs细胞PPARγ蛋白水平的降低 （图2）。

图2 OA对ox-LDL抑制HUVECs细胞PPARγ蛋白表达水平的影响

表1 OA对ox-LDL抑制HUVECs细胞氧化损伤的影响（±s）

表1 OA对ox-LDL抑制HUVECs细胞氧化损伤的影响（±s）

注：与对照组比较，aP ＜ 0.01；与ox-LDL组比较，bP ＜ 0.01

分组样本数SOD（μmol/g）GSH（μmol/g）MDA（kU/g）ROS相对荧光强度（%）对照组316.12±0.06132.16±2.112.03±0.04100.04±0.45 ox-LDL3 5.43±0.08a 49.72±1.28a 2.63±0.02a 158.12±0.39a ox-LDL+OA（10 μmol/L）3 10.60±0.14b 108.36±2.05b 2.41±0.21b 136.18±1.24b ox-LDL+OA（20 μmol/L）3 13.28±0.09b 129.58±0.09b 2.26±0.15b 126.43±1.51b ox-LDL+OA（40 μmol/L）3 14.86±0.16b 131.47±0.76b 2.14±0.08b 112.39±1.07b F值26.3831.2756.8241.16 P值 0.005 0.004 0.002 0.003

表2 PPARγ抑制剂对OA抗ox-LDL抑制HUVECs细胞氧化损伤的影响（±s）

表2 PPARγ抑制剂对OA抗ox-LDL抑制HUVECs细胞氧化损伤的影响（±s）

注：与对照组比较，aP ＜ 0.01；与ox-LDL组比较，bP ＜ 0.01；与各自ox-LDL+OA组比较，cP ＜ 0.01

分组样本数SOD（μmol/g）GSH（μmol/g）MDA（kU/g）ROS相对荧光强度（%）对照组3 17.05±0.12135.28±2.142.16±0.15100.53±1.08 ox-LDL3 6.41±0.04a 50.38±0.13a2.71±0.12a160.05±0.46a ox-LDL+OA（10 μmol/L）3 10.58±0.13b 102.46±0.06b2.42±0.08b144.38±2.02b ox-LDL+OA（20 μmol/L）3 13.25±0.05b 122.59±0.33b2.23±0.16b123.94±0.15b ox-LDL+OA（40 μmol/L）3 15.88±0.14b 140.26±1.05b2.02±0.13b187.52±0.68b oxLDL+OA(10 μmol/L)+GW96623 8.42.±0.05c 88.38±0.48c2.83±0.01c154.41±1.04c oxLDL+OA(20 μmol/L)+GW96623 10.59.±0.12c 106.42±0.15c2.61±0.07c138.12±1.15c oxLDL+OA(40 μmol/L)+GW96623 13.65.±0.03c 124.61±1.27c2.49±0.04c126.51±0.73c GW96623 16.02±0.13130.14±2.041.98±0.29103.15±0.29 F值35.0842.3126.8433.73 P值0.0030.0010.0040.003

四、PPARγ抑制剂部分逆转OA对ox-LDL抑制HUVECs细胞活力的拮抗作用结果

为了探讨PPARγ在OA抗ox-LDL导致的HUVECs细胞氧化损伤的作用，首先检测了PPARγ抑制剂GW9662（10 μmol/L）预处理对OA拮抗ox-LDL导致的HUVECs细胞活力降低的影响。结果显示，与ox-LDL+OA（20 μmol/L）组比较，ox-LDL+OA（20 μmol/L）+GW9662组的细胞活力明显降低，为（63.31±1.15）%。以上结果表明GW9662预处理可部分逆转OA对ox-LDL导致的HUVECs细胞存活率降低的拮抗作用，提示PPARγ蛋白可能参与了OA的抗ox-LDL导致的HUVECs细胞氧化损伤作用（图3）。

图3 PPARγ抑制剂对OA抗ox-LDL抑制HUVECs细胞活力的影响

五、PPARγ抑制剂可减弱OA对ox-LDL诱导HUVECs细胞氧化损伤的改善作用结果

接下来本研究探讨PPARγ抑制剂GW9662对OA抗ox-LDL诱导HUVECs细胞氧化损伤的逆转作用，以进一步阐明PPARγ蛋白对OA拮抗ox-LDL诱导HUVECs细胞氧化损伤的介导作用。结果显示，与ox-LDL+OA（10 μmol/L）组比较，ox-LDL+OA（10 μmol/L）+GW9662组的SOD、GSH水平明显降低而MDA、ROS水平明显升高与ox-LDL+OA（20 μmol/L）组比较，ox-LDL+ OA（20 μmol/L）+GW9662组的SOD、GSH水平明显降低而MDA、ROS水平明显升高与ox-LDL+OA（40 μmol/ L）组比较，ox-LDL+OA（40 μmol/ L）+GW9662组的SOD、GSH水平明显降低，而MDA、ROS水平明显升高。此外，本研究还发现，抑制PPARγ后，OA抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞的氧化损伤仍存在剂量效应。以上结果表明PPARγ抑制剂GW9662OA预处理可减弱OA对ox-LDL诱导的HUVECs细胞SOD，GSH含量降低以及ROS和MDA水平增加的抑制作用，提示OA可通过PPARγ拮抗ox-LDL导致的HUVECs细胞氧化损伤（表2）。

讨 论

氧化应激在心血管疾病的发生发展中扮演着重要角色，特别是活性氧常常伴随在AS的发展过程中[10-11]。过多活性氧的产生可直接损伤细胞膜、蛋白质和DNA。且线粒体DNA对氧化损伤极其敏感[11]。最近有研究表明，活性氧水平的增加参与炎症的发生，可导致血流量和剪切应力的异常以及诱导动脉壁的重塑[12]。正常生理条件下，机体的抗氧化系统能够消除多余的活性氧，发挥抗氧化应激功能。然而，当机体处于病理状态时，细胞内活性氧生成量增加，抗氧化物酶活性受到抑制，进而损伤蛋白质、脂质和核酸等生物大分子，导致细胞功能发生障碍，最终诱导有关疾病的形成[13-14]。机体调控活性氧的抗氧化剂主要有由抗氧化剂如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）以及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）[15]。有研究表明，ox-LDL的生产量增加可促进AS进程[16]。GALLE和他的同事等发现，浓度为10 ～ 300 mg/L的ox-LDL可诱导HUVEC细胞中活性氧的产生，并呈浓度依赖性关系，且高浓度的ox-LDL可诱导内皮细胞发生死亡[17]。

OA是一种天然的五环三萜类化合物，普遍存在于许多的药用植物中，能够产生抗氧化效应。目前的研究资料表明，OA在治疗氧化应激有关的疾病包括炎症、糖尿病以及癌症等方面取得了明显的效果[18]。研究进一步发现，OA的抗氧化作用与其提高多种抗氧化酶的活性有关[19]。本研究结果显示，浓度为10 μmol/L，20 μmol/L和40 μmol/L的OA预处理可显著减弱ox-LDL对HUVECs细胞存活率的抑制作用，且呈浓度依赖性关系。为了探讨OA对ox-LDL诱导的HUVECs细胞氧化应激的影响，本研究检测了OA对ox-LDL作用下的抗氧化剂SOD和GSH活性以及氧化应激相关指标ROS和MDA水平的影响。结果显示，OA预处理可减弱ox-LDL诱导HUVECs细胞SOD，GSH含量的降低。同时，OA预处理可拮抗ox-LDL诱导HUVECs细胞ROS和MDA水平的增加。以上结果表明OA可改善ox-LDL诱导HUVECs细胞的氧化损伤。

PPARγ是核受体超家族成员之一，其在心血管疾病中起重要作用。PPARγ可通过抗炎，保护血管内皮细胞以及抑制血管平滑肌增殖和迁移作用发挥抗AS功能[9]。有趣的是，γ-谷氨酰半胱氨酸乙酯对环磷酰胺诱导的肝损伤的保护作用与PPARγ的表达上调以及氧化应激的减弱有关[20]。以上资料提示，PPARγ在OA抗ox-LDL诱导HUVECs细胞的氧化损伤中具有重要作用。于是，首先检测了OA对ox-LDL作用下的HUVECs细胞中PPARγ蛋白表达的影响。结果显示，OA能剂量依赖性的抑制ox-LDL诱导的PPARγ蛋白水平的下调，这表明OA可减弱ox-LDL导致的HUVECs细胞PPARγ蛋白水平的降低。为了进一步确定PPARγ蛋白是否参与OA的抗ox-LDL导致的HUVECs细胞氧化损伤作用，接着探讨了PPARγ抑制剂GW9662预处理对OA抗ox-LDL诱导HUVECs细胞氧化损伤的影响，以阐明PPARγ蛋白对OA拮抗ox-LDL导致的HUVECs细胞氧化损伤的介导作用。结果显示，PPARγ抑制剂可逆转OA对ox-LDL抑制HUVECs细胞活力的拮抗作用。此外，抑制PPARγ后，OA减弱ox-LDL诱导的HUVECs细胞活性降低仍存在剂量效应。本研究进一步发现PPARγ抑制剂GW9662OA可减弱OA对ox-LDL诱导HUVECs细胞，SOD，GSH含量的降低以及ROS和MDA水平的增加的抑制作用。此外，抑制PPARγ后，OA抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞的氧化损伤仍存在剂量效应。这表明抑制PPARγ蛋白表达可部分逆转OA对ox-LD导致的HUVECs细胞氧化损伤，提示OA可通过PPARγ拮抗ox-LDL导致的HUVECs细胞氧化损伤。

综上所述，OA对ox-LDL诱导的HUVECs细胞氧化产生保护作用的分子机制与其调控PPARγ蛋白有关，这为OA治疗AS的分子机制提供了新的视角。

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