高效液相色谱法同时测定复杂食品基质中8种合成色素的含量

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(河北出入境检验检疫局 检验检疫技术中心保定分中心, 保定 071051)

近年来,一些食品生产厂商为了提高食品的商业价值,利用合成色素即人工色素对食品进行着色,使其更加鲜艳美观,促进消费[1-10]。然而,几乎所有的合成色素都不能向人体提供营养物质,反而危害人体健康。合成色素多以苯、甲苯、萘等化工产品为原料,经过一系列有机反应而成,长期低剂量摄入会导致生育力下降、畸胎,影响儿童智力发育,引发儿童过激行为。合成色素还会在体内转换成致癌物质,特别是偶氮类化合物的致癌作用更为明显。但由于合成色素价格低廉,着色力强,超标使用的现象屡见不鲜[11-13]。国家标准GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中规定了各类食品中各种色素的使用限量,柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红禁用于肉制品,诱惑红限用于西式火腿类、肉灌肠类和可食用动物肠衣类食品。

目前,高效液相色谱法是合成色素的主要检测方法,由于传统方法检测时间长,工作量大,一些复杂基质如肉肠类、茶叶、硬糖类样品经常出现回收率低、检测结果不稳定、存在杂峰干扰的现象。本工作采用固相萃取-高效液相色谱法同时测定复杂基质中的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红、酸性红、赤藓红、亮蓝等8种合成色素的含量,为食品中多种易超标合成色素提供快速的检测方法。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

岛津LC-20A型高效液相色谱仪,配岛津LC-20A系列真空脱气机,自动进样器和二极管阵列检测器(PDA);ProElut PWA-2固相萃取柱(150 mg/6 mL)。

0.02 mol·L-1乙酸铵溶液:称取乙酸铵1.54 g,加少量水溶解,转移至1 L容量瓶中,用水定容,用0.45 μm滤膜过滤。

提取溶剂:移取乙醇30 mL,乙腈30 mL,甲醇30 mL,氨水10 mL,混匀。

苋菜红、胭脂红、柠檬黄、日落黄、亮蓝标准溶液,质量浓度均为0.500 g·L-1,诱惑红、赤藓红标准溶液,质量浓度均为1.00 g·L-1。

酸性红标准品纯度为93.5%,甲酸、甲醇、乙腈为色谱纯,无水乙醇、氨水为分析纯,乙酸铵为优级纯;试验用水为一级水。

1．2 仪器工作条件

Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温35 ℃;流动相A为乙腈,B为0.02 mol·L-1乙酸铵溶液,流量1.0 mL·min-1;检测波长254 nm;进样量20 μL。梯度洗脱程序:0 min时,A为5%;20 min时,A为30%;30 min时,A为37%;31～40 min时,A为5%。

1．3 试验方法

称取样品1.000 g至50 mL离心管中,加入提取溶剂20 mL,漩涡振荡2 min,超声提取10 min后,以6 000 r·min-1转速离心2 min,收集上清液。取下层残留物,加入提取溶剂10 mL,漩涡振荡2 min,超声提取15 min后,以6 000 r·min-1转速离心2 min,收集上清液。将下层残留物用10 mL提取溶剂按照上一步骤重复提取1次,合并3次上清液。将上清液在40 ℃水浴条件下,减压蒸发浓缩至约3 mL,加入水2 mL,混匀,用甲酸将pH调至5.0左右,待ProElut PWA-2小柱净化。

ProElut PWA-2小柱使用前依次用甲醇5 mL活化、水5 mL平衡。将全部待净化液上样至小柱,流量控制在0.05 mL·s-1以内,弃去流出液。依次加入2%(体积分数,下同)甲酸溶液5 mL、水5 mL和甲醇5 mL冲洗小柱,弃去流出液,并用洗耳球吹干。最后加入氨水-甲醇(15+85)溶液5 mL洗脱小柱,收集洗脱液。将洗脱液在50 ℃下氮吹至约0.5 mL,用0.02 mol·L-1乙酸铵溶液定容至1 mL,经0.45 μm滤膜过滤,在仪器工作条件下进行测定。

2 结果与讨论

2．1 提取方法

肉制品基质复杂,样品中含有大量的脂肪和水溶性蛋白质。茶叶成分种类繁多,有水、蛋白质、氨基酸、咖啡因、多元酚类、碳水化合物、脂质、矿物质、植物色素、维生素等,脂质、植物色素等难溶于水的物质增加了提取难度。硬糖是由各类调料和芳香化合物调制而成,生产过程中添加了大量色素。同时检测复杂基质中的8种合成色素时,采用合适的提取溶剂对保证结果准确尤为重要。柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红、酸性红、赤藓红、亮蓝等偶氮类化合物易溶于水,难溶于乙醇,不溶于油脂。而蛋白质为水溶性,直接用水提取极易造成系统的污染,因此选用有机溶剂提取,将样品中的脂肪除去。蛋白质不溶于乙醇,在溶剂中加入乙醇,可以将不溶于醇的蛋白质除去,将色素分离出来。由于色素在乙醇中的溶解度很低,加入少量氨水,提高色素的溶解度,使色素更容易被提取。因此,试验选用乙醇-乙腈-甲醇-氨水混合溶液作为提取溶剂。

2．2 固相萃取柱的选择

提取剂可同时将色素和某些脂溶性成分提取出来,形成杂质干扰,影响基线的稳定性,因此选择固相萃取小柱进行净化。试验考察了3种不同分离模式的固相萃取小柱(Waters oasis HLB固相萃取柱、ProElut PLS固相萃取柱和ProElut PWA-2固相萃取柱)。Waters oasis HLB柱以亲水亲脂的水可浸性共聚物为固定相,吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮按一定比例聚合而成的大孔共聚物,保留机理为反相。ProElut PLS柱兼具亲水基团(吡咯烷酮基团)和疏水基团(二乙烯基苯),属于反相吸附剂,对极性化合物和非极性化合物均有较好的保留,具有亲水亲脂平衡的特性,对于碱性化合物有很好的分离效果。ProElut PWA-2柱的固定相为含亲水基团的聚苯乙烯、二乙烯基苯的共聚物,作用基团为哌嗪基团、苯基、乙烯基和吡咯烷酮基,保留机理主要为阴离子交换相互作用和非极性相互作用,其次是极性相互作用,主要用于分离纯化强酸性化合物,比如含有磺酸基团的化合物。

试验发现, Waters oasis HLB柱对苋菜红、亮蓝和赤藓红的回收率较低,赤藓红回收率仅为13%。而对比ProElut PLS柱与ProElut PWA-2柱发现,ProElut PWA-2柱的回收率较高,可能是由于ProElut PWA-2柱的固定相是混合型弱阴离子交换吸附剂,具有弱阴离子交换和反相保留两种模式,可以有效去除干扰,提高回收率。8种合成色素中,除赤藓红为苯甲酸钠结构外,其他均为苯磺酸钠结构,含有磺酸基,属于强阴离子化合物,利用弱阴离子交换形成保留。而赤藓红回收率偏低可能是由于它的苯甲酸钠结构相对于苯磺酸钠结构保留性偏弱。因而试验采用ProElut PWA-2固相萃取柱。

2．3 色谱条件的选择

试验选取了乙腈-水、乙腈-乙酸铵、甲醇-乙酸铵等不同流动相进行样品分析,结果表明:乙腈和水为流动相无法使合成色素分离,甲醇-乙酸铵无法使部分合成色素有效分离,而乙腈-乙酸铵体系可以使8种合成色素得到有效分离,峰形最佳。进一步选用0.01,0.02,0.03,0.04,0.05 mol·L-1乙酸铵溶液进行比较,发现使用0.02 mol·L-1乙酸铵溶液时,8种合成色素的分离效果达到最好,当乙酸铵溶液浓度再增大时,峰形和分离效果无明显改善,因此试验选用乙腈-0.02 mol·L-1乙酸铵溶液作为流动相体系。8种合成色素的混合标准溶液的色谱图见图1。

图1 8种合成色素的混合标准溶液的色谱图Fig. 1 Chromatogram of the mixed standard solution of eight kinds of synthetic colorants

选取空白猪大肠样品,添加8种合成色素的标准品,按试验方法制备样品溶液,其色谱图见图2。

图2 空白样品加标后的色谱图Fig. 2 Chromatogram of blank sample after addition with standard substances

2．4 标准曲线与检出限

分别取8种色素的标准溶液或标准品,用水配制成0.25,2.0,5.0,10.0,15.0 mg·L-1的混合标准溶液系列,按试验方法进行测定,分别以8种物质的质量浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得到线性范围、线性回归方程及相关系数见表1。

以3倍信噪比计算检出限(3S/N),结果见表1。

2．5 精密度和回收试验

选取空白猪大肠样品,分别加入8种合成色素方法检出限浓度的1倍、2倍、10倍的标准溶液于样品中,按试验方法处理样品并平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

由表2可知:加标回收率在84.6%～99.0%之间,RSD在1.4%～2.5%之间,完全符合检测要求。

表1 线性参数与检出限Tab. 1 Linearity parameters and detection limits

表2 精密度与回收试验结果(n=6)Tab. 2 Results of tests for precision and recovery(n=6)

同时选取空白茶叶、硬糖样品进行精密度和回收试验,回收率和精密度也均满足检测要求。

本方法利用固相萃取柱对色素进行富集和净化,采用高效液相色谱法同时测定复杂食品基质中的8种合成色素,缩短了检测时间,提高了工作效率,对复杂基质能有效提高检测的准确性,可用于测定各种复杂基质样品中的多种添加合成色素。

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