超声辅助深共熔溶剂提取两种烟草多酚的方法研究

尚宪超，谭家能，杜咏梅，刘新民，张忠锋

（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

绿色化学是指在制造和应用化学产品时应有效利用（最好可再生）原料，消除废物和避免使用有毒和危险的试剂和溶剂[1]。自从绿色化学概念被提出以来，新型绿色溶剂的开发一直占据着至关重要的位置。作为绿色溶剂必须符合以下条件：原料易得、没有毒性、成本低且可生物降解。在过去20年，“绿色溶剂”离子液体因具有蒸汽压低、不可燃、溶解性和导电性优良、电化学稳定窗口宽等独特的物理化学性质，在分离技术、生物催化、有机合成和电化学等领域倍受关注[2]。然而，离子液体存在合成过程复杂、提纯困难、成本较高等缺点，从而限制了其大规模工业化应用和发展。此外，最新有关离子液体毒理研究表明，吡啶和咪唑类离子液体并非完全“绿色”，其毒性与传统有机溶剂相当，咪唑类离子液体毒性甚至大于传统有机溶剂[3-4]。因此，寻找合成简单、经济且更为绿色的替代新型绿色溶剂意义重大。

深共熔现象又称低温共熔，是指将两种或两种以上固体物质加到一起，使其混合物的熔点发生下降的现象。ABBOTT等[5]研究发现，季铵盐可以和酰胺类化合物形成低温共熔体系，并称之为深共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents,DES）。这种溶剂无毒性，可生物降解，且合成过程中原子利用率达100%，是一种新型的绿色溶剂。深共熔溶剂是由两到三种成本低、无毒的物质通过氢键作用构成，其具有离子液体的优良物理化学性质，并具备生物可降解性、合成路线简单等离子不具备特点。因此，深共熔溶剂一经发现就迅速进入人们的视线，并在电化学、化学合成、纳米材料制备、提取分离等领域中得到广泛的应用[6]。

烟草作为一种重要经济作物，含有相当丰富的有机化合物。烟叶中目前被鉴定的化学物质约有2549种，多酚是其中一类重要物质[7-9]。目前烟草中发现多酚类化合物包括单宁类（绿原酸及其衍生物、咖啡酸等），香豆素类（莨菪亭），黄酮类（芸香苷等）和简单酚类衍生物等，其中绿原酸、芸香苷是烟草中最主要的酚类化合物。多酚类化合物是烟草中重要指标化合物，一般优质的烟叶含有较多的绿原酸和芸香苷。另外，多酚类化合物还是一类重要生物活性物质，绿原酸、芸香苷具有抗氧化和降低自由基活性的功能，并在食品抗氧化剂，抗心血管病、癌症、人体衰老药物中有着广泛应用[10-11]。

目前，烟草多酚分析方法中使用的仍是传统的有机溶剂法，即有机溶剂浸提、分析检测[12-14]。这种提取技术无法避免使用大量有机溶剂，而使用有机溶剂不符合当前化学领域中提倡的可再生、环境兼容和可持续发展的新理念。因此本研究致力于发展一种绿色溶剂高效、快速检测烟草多酚的方法。首先比较了深共熔溶剂种类及含水量对提取结果的影响。然后通过正交试验方法优化重要的参数（温度、时间和料液比）。最后，还研究了从DES溶剂中回收活性化合物的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：Waters UPLC H-CLASS超高压液相色谱仪；万分之一电子天平；IKA磁力搅拌器；KQ-500GVDV型双拼恒温数控超声波发生器。

试剂：氯化胆碱、葡萄糖、乳酸、乙二酸、尿素、苹果酸、丙三醇、甜菜碱、脯氨酸为化学纯，购买于阿拉丁试剂公司；乙二醇、丙二酸、1,4-丁二醇为化学纯，购买于国药集团化学试剂公司；绿原酸、芸香苷为分析纯，购买于上海源叶生物科技有限公司；Waters Oasis HLB固相萃取柱，购买于Waters公司；甲醇为色谱纯，购买于德国MERCK公司。

1.2 材料的预处理

将新鲜烟叶（品种为红花大金元，由云南省大理市试验站提供）于60℃烘干，制成40目粉末，4℃冰箱中贮存，作为绿原酸、芸香苷提取的原料。

1.3 色谱条件

分析条件：流动相A为甲醇，流动相B为0.5%醋酸水溶液。梯度洗脱程序：0～5 min，18%A，82%B;5～6 min，18%～40%A，82%～60%B;6～9 min，40%～90%A，60%～10%B;9～11 min，90%～100%A，10%～0%B;11～14 min，100%～60%A，0%～40%B;14～15 min，60%～18%A,40%～82%B。BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速 0.3 mL/min；进样量 3 μL；柱温 35 ℃；检测波长340 nm。

标准曲线：称取绿原酸纯品111.8 mg、芸香苷13.3 mg，用50%甲醇水溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中。将上述溶液转移到200 mL容量瓶中，并用甲醇定容。分别吸取上述溶液1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 mL于100 mL容量瓶中，用50%的甲醇溶液定容，配置成系列标准溶液。利用UPLC法，以峰面积对质量浓度做标准曲线。在此质量浓度范围内，绿原酸的线性回归方程为Y=16099X-41253（R2=0.999，n=6），标准曲线的线性范围为5.59～89.44 μg/mL；芸香苷的线性回归方程为Y=13115X+958.9（R2=0.999，n=6），标准曲线的线性范围为0.67～10.64 μg/mL。

绿原酸、芸香苷质量分数的测定方法：绿原酸、芸香苷的测定采用YC/T202—2006烟草及烟草制品多酚类化合物绿原酸、莨菪亭和芸香苷的测定。标准品及样品中目标化合物的色谱分离图如图1所示，化学结构[9,11]如图2所示。

图1 绿原酸（A）及芸香苷（B）标准溶液（1）和烟草样品（2）色谱分离图Fig.1 UPLC chromatograms of the standards(1)and target compounds(2):Chlorogenic acid(A),rutin(B)

图2 绿原酸及芸香苷化学式Fig.2 The structures of target phenolic compounds

1.4 试验方法

1.4.1 深共熔溶剂制备 深共熔溶剂由氯化胆碱（甜菜碱或脯氨酸）与不同氢键供体（葡萄糖、乳酸、乙二酸、苹果酸、乙二醇、丙二酸、1,4-丁二醇、尿素）加热搅拌生成。分别称取氯化胆碱7.0 g（50 mol）、葡萄糖9.0 g（50 mol）放置于100 mL圆底烧瓶中，80℃下磁力搅拌4～6 h，得到无色透明液体，之后冷却至室温，制得新型低共熔溶剂。然后分别称取不同质量乳酸、乙二酸、苹果酸、乙二醇、丙二酸、1,4-丁二醇、尿素，依照上述制备方法，分别与氯化胆碱合成不同类型深共熔溶剂[15]。

1.4.2 提取方法 准确称取10 mg烟末置于提取器中，加入1 mL深共熔溶剂，混匀，一定条件下超声萃取，然后用50%甲醇将提取液定容至10 mL，滤膜过滤，取1 mL滤液用色谱仪器分析。每个样品均重复检测2次。优化条件包括：深共熔溶剂种类、含水量（0～50%）、料液比（1∶25～1∶200）、温度（30～60℃）及时间（10～50 min）。

1.4.3 DES提取液中多酚的回收 活化好的固相萃取柱（Waters Oasis HLB）装入2 mL的DES提取液并洗脱。首先用去离子水清洗直至DES全部洗脱。然后用甲醇（50 mL）洗脱，收集组分用旋转蒸发仪旋干。样品用10 mL 50%甲醇溶解，用于液相色谱分析。

2 结果

2.1 深共熔溶剂种类对绿原酸、芸香苷提取量的影响

深共熔溶剂的组成对其理化性质（极性、粘度和溶解性）有很大的影响，而这些理化性质直接影响目标化合物的提取效率[16-18]。为了选择一个适合烟草多酚提取的深共熔溶剂，本研究共合成11种深共熔溶剂，其组成及摩尔比如表1所示。11种深共熔溶剂按氢键供体分成4类：氯化胆碱-丙三醇、氯化胆碱-1,4-丁二醇、氯化胆碱-尿素-丙三醇、甜菜碱-丙三醇、脯氨酸-丙三醇，氢键供体为多元醇；氯化胆碱-尿素，氢键供体为酰胺类；氯化胆碱-葡萄糖，氢键供体为糖类；氯化胆碱-乳酸、氯化胆碱-丙二酸、氯化胆碱-乙二酸、氯化胆碱-苹果酸，氢键供体为羧酸类。

表1 深共熔溶剂组成Table 1 Composition of the DESs

超声辅助提取条件下，温度设定40℃、提取时间为30 min，水/深共熔溶剂体积比为4/6（V/V），并以传统有机溶剂甲醇-水为比对。结果如图3所示，氢键供体为羧酸类时（DES-4、DES-6、DES-7），深共熔溶剂对绿原酸提取效率明显优于氢键供体为多元醇、糖类、酰胺类深共熔溶剂。其中，DES-4、DES-6提取效率与甲醇-水相当，最优为氯化胆碱-苹果酸（DES-7）。而芸香苷结果表明，氯化胆碱-葡萄糖（DES-1）、氯化胆碱-丙三醇（DES-3）、氯化胆碱-1,4-丁二醇（DES-4）、氯化胆碱-苹果酸（DES-7），这4种深共熔溶剂提取效率更高。选取氯化胆碱/苹果酸作为提取溶剂，40%（V/V）的水为辅助溶剂，提取温度为40℃，提取时间为30 min条件下，绿原酸、芸香苷提取量分别为（16.12±0.62）、（8.53±0.52） mg/g。

2.2 深共熔溶剂含水量对绿原酸、芸香苷提取量的影响

文献报道，DES溶剂应用于橄榄油中酚类化合物分离过程中，含水量影响显著，合适的水含量可以提高提取效率[19]。在相同的超声辅助提取条件下，温度设定50℃、提取时间为20 min，如图4a，加入一定体积水后，目标化合物的提取率增加1.1～1.4倍。40%（V/V）含水量的深共熔溶剂对绿原酸及芸香苷的提取率最高。

2.3 提取温度、时间、料液比

图3 深共熔溶剂种类对绿原酸及芸香苷提取量的影响Fig.3 The effect of DES on the extraction of two target phenolic acids from tobacco

图4 不同含水量（a）、温度（b）、时间（c）和料液比（d）对两种多酚提取量影响.Fig.4 Concentrations of the two phenolic compounds a at different water content in DES,b at different temperatures c for different

如图4b，在其他条件不变情况下，温度30～50℃范围内，绿原酸及芸香苷提取量随温度升高略微增加，在50℃时达到最大值。随着温度继续升高，2种多酚提取量无明显变化；如图4c，时间5～20 min范围内，绿原酸及芸香苷提取量随时间的延长而升高，到20 min时接近最大值。再随着时间延长，2种多酚提取量无明显变化；如图4d，料液比1∶25～1∶100范围内，绿原酸及芸香苷提取量随料液比的增大而升高，到1∶100时接近最大值。

2.4 正交试验

根据单因素试验的结果，选取影响烟草多酚提取效果的温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）作为3个考察因素，选取3个水平，采用L9（33）正交表设计正交试验（表2），对结果进行极差分析，以确定最佳的提取条件。

表2 深共熔溶剂提取烟草多酚正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels for L9(33)orthogonal array design

绿原酸正交试验结果见表3。由表3的极差（R）分析结果可以看出，RB＞RA＞RC，3个因素对烟草绿原酸的提取率影响大小依次为萃取时间（B）＞萃取温度（A）＞料液比（C）。3因素中，萃取时间与萃取温度的影响较为显著，其中，萃取时间的提取作用最为显著。在实验设计范围内，优化得到深共熔溶剂提取烟草绿原酸的最佳条件为A2B3C2，即萃取温度50℃、萃取时间30 min、料液比1∶100。芸香苷正交试验结果见表4。由表4的极差分析结果可以看出，RB＞RC＞RA，3个因素对芸香苷的提取率影响大小依次为：萃取时间（B）＞料液比（C）＞萃取温度（A）。3因素中，萃取时间与料液比的影响较为显著，其中，萃取时间的提取作用最为显著。在实验设计范围内，优化得到深共熔溶剂提取烟草绿原酸的最佳条件为A2B3C2，即萃取温度50℃、萃取时间30 min、料液比1∶100。

2.5 活性化合物回收

固相萃取柱（Waters Oasis HLB）对酚酸有良好的吸附和解吸能力，被用于从DES提取液中回收两种酚类化合物。在洗脱过程中，由于DES溶剂的强极性和水溶性，DES溶剂首先被水洗脱。而进一步用醇类溶剂洗脱可回收酚类化合物。结果显示，绿原酸、芸香苷的回收率分别为91.67%和99.81%，综合提取率为99.86%。证明了酚类化合物可以从DES提取物中有效地回收。水相洗脱液旋蒸除去溶剂后，除部分烟草水溶物（烟草糖类、生物碱、有机酸及无机离子）外，大部分为深共熔溶剂，如何有效回收深共熔溶剂需今后进一步研究。

表3 深共熔溶剂提取绿原酸正交试验设计及结果Table 3 L9(33)orthogonal array design and results for chlorogenic acid

表4 深共熔溶剂提取芸香苷正交试验设计及结果Table 4 L9(33)orthogonal array design and results for rutin

3 讨论

对比不同深共熔溶剂对两种多酚化合物提取量的影响可以看出，氯化胆碱/苹果酸组成的DES对两种多酚化合物的提取效果最优，故本实验选择DES氯化胆碱-苹果酸作为最佳提取溶剂。由于绿原酸和芸香苷与DES氯化胆碱-苹果酸均存在较强的氢键相互作用，两种烟草多酚能够快速分散到DES中，因此采用DES氯化胆碱-苹果酸进行综合提取。艾心灵等[13]用95%乙醇进行综合提取，提取率仅为93.65%，提取率较低，提取温度较高（80℃），提取时间较长（90 min）。而本方法采用氯化胆碱-苹果酸组成的DES对烟草中绿原酸、芸香苷进行综合提取，具有较短的提取时间（30 min）、较低的提取温度（50℃）以及较高的提取率（99.86%）。由于DES绿色无毒，本提取方法有望实现烟草中活性成分的规模化制备。研究中发现，本方法所用DES粘度差异较大，DES粘度影响多酚化合物提取效果的规律，需今后进一步探究。

4 结论

新型绿色溶剂——深共熔溶剂被首次应用于烟草多酚类化合物提取。结果表明，深共熔溶剂是一种理想的有机酸的提取溶剂，能有效提高酚酸类物质的溶解性。经过条件优化后，深共熔溶剂氯化胆碱-苹果酸具有较高的提取效率。最佳条件为：DES中水含量为40%，料液比为1∶100，提取温度50℃，提取时间30 min。该条件下，绿原酸、芸香苷提取量达到最优，分别为（16.95±0.69）、（8.53±0.52） mg/g。

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