遗传性耳聋基因芯片在新生儿耳聋基因筛查中的应用

马 宁 杨 晓 彭 薇 李 昊 王 艳

中国人民解放军陆军总医院附属八一儿童医院发育生物学实验室，出生缺陷防控关键技术国家工程实验室，儿童器官功能衰竭北京市重点实验室（北京，100700）

遗传性耳聋基因芯片在新生儿耳聋基因筛查中的应用

马 宁 杨 晓 彭 薇 李 昊 王 艳

中国人民解放军陆军总医院附属八一儿童医院发育生物学实验室，出生缺陷防控关键技术国家工程实验室，儿童器官功能衰竭北京市重点实验室（北京，100700）

目的：探索应用遗传性耳聋基因芯片对新生儿进行常见耳聋基因的筛查，为辅助临床诊断提供遗传咨询。方法：采集2085例新生儿足跟血，制成干血斑，提取血斑中淋巴细胞基因组DNA，用9项遗传性耳聋基因检测试剂盒检测中国人常见的4个耳聋基因的9个突变位点。结果：共检出73例突变，总突变率3．5%。其中GJB2突变28例，线粒体突变5例，SLC26A4突变34例，GJB3突变5例，三杂合突变1例（235delC杂合突变299delAT杂合突变IVS7－2A＞G杂合突变）。结论：正常人群也会携带常见的遗传性耳聋突变基因，在新生儿期，检测出耳聋基因突变对遗传性耳聋的早期发现、预防及治疗有很大帮助。

新生儿；遗传性耳聋；基因芯片；GJB2基因；12SrRNA基因；SLC26A4基因；GJB3基因

导致听力损失的因素包括环境因素和遗传因素，另外还包含一些不明原因，其中遗传因素占60%［1］。听力障碍会直接影响患儿的语言发育，从而导致由聋致哑，给患儿的生长发育及社会生活带来非常严重的影响。而常规听力学筛查无法发现迟发型、药物敏感性和渐进性耳聋患者。因此，为了早发现、早诊断、早干预，本院对2085例新生儿进行了9项耳聋基因筛查，本文对此进行总结分析。

1 对象与方法

1．1 筛查对象

新生儿家长签署知情同意书后，采集2085例新生儿的足跟血干血斑，共3个血斑。经干血斑基因组DNA提取试剂盒提取DNA后，－20℃低温冰箱保存备用。

1．2 试 剂 盒

9项遗传性耳聋基因检测试剂盒［微阵列芯片法，国食药监械（准）字2013第3401518号，北京博奥晶典生物技术有限公司提供］可检测4个基因9个突变位点，包括 GJB2（35delG、176del16、235delC和299delAT）、GJB3（C538T）、SLC26A4（IVS7－2A＞G、A2168G）以及线粒体12SrRNA（A1555G、C1494T）。

1．3 设 备

晶芯LuxScanTM10K－A微阵列芯片扫描仪、洗干仪、杂交仪及配套分析软件（北京博奥晶典生物技术有限公司）。

1．4 方 法

PCR反应：4个基因9个突变位点分成A和B两个反应体系进行多重PCR扩增，在A和B扩增体系中加入5μl待测人基因组DNA （浓度2～20ng／μl）、扩增引物混合物和扩增试剂混合物各10μl。PCR 扩增程序：37℃10min，95℃ 15min，96℃1min，94℃ 30s，55℃ 30s，70℃45s，32个循环，60℃10min，55℃30s处设置降温速率0．4℃／s，在70℃45s处设置升温速率0．2℃／s。扩增结束进行杂交、清洗和扫描，最终根据产品配套分析软件得到结果。

2 结果

2085例新生儿中共检出73例基因突变，突变率3．5%。其中68例为单杂合突变型（为耳聋基因突变携带者），1例为1555A＞G异质突变，4例为1555A＞G均质突变型，1例为双杂合突变型。见表1。

表1 73例新生儿基因突变位点

3 讨论

遗传性耳聋基因诊断芯片可同时检测先天性耳聋、药物敏感性耳聋和迟发性耳聋相关4个基因中的9个突变位点，具有通量高，操作简便，自动化的特点。用于新生儿筛查，可以弥补常规听力学筛查的不足，可筛查出新生儿常规听力学筛查无法筛出的迟发型耳聋、药物敏感性耳聋或者渐进性耳聋的新生儿，为新生儿的用药治疗和生长发育评估都提供了可靠依据。

SLC26A4基因与大前庭导水管综合征相关，它同时也是耳聋常见突变基因，其发生纯合突变一般会导致迟发型耳聋，而常规听力筛查无法检出，所以需要借助基因检测联合筛查。SLC26A4基因某一位点纯合突变或两个位点复合杂合突变，提示为先天性耳聋或后天迟发性耳聋的患者，建议结合影像学检查结果进一步判断，指导患者日常行为及注意事项，此种先天性耳聋具有良好的人工耳蜗植入治疗效果。在2085例新生儿中检出34例SLC26A4基因突变型，且都为杂合突变型，携带率为1．63%。

GJB2基因突变是最常见耳聋基因，它的遗传方式为常染色体隐性遗传。前庭水管综合征是近30年发现的一种能够根据影像学分类的感音神经性耳［2－3］，随着颞骨 CT 和 MRI在中国的逐渐普及［4］，此病的发现日趋频繁。此综合征的特点多为双侧感音神经性耳聋，CT或MRI提示前庭水管或内淋巴囊扩大，一部分患者出生时可能听力正常，听力下降程度在不同的个体具有较大的差别，从听力完全正常至中重度听力损失，因堕床、儿童玩耍或体育活动中的轻度碰撞或感冒可以造成明显的听力下降［5］，也存在无明显诱因而发生听力下降的情况。在2085例新生儿中检出28例为GJB2。均为杂合突变型，携带率1．34%和1．65%。

GJB2基因和SLC26A4基因都是以隐性遗传方式遗传，本次筛查出的63份样本均为杂合突变型，未检出以上两个基因的纯合突变型。但检出1例为235、299和IVS7－2双杂合突变，并且听力学筛查未通过，可以确定为先天性耳聋患者。需要及早进行人工耳蜗移植以避免由聋致哑。通过筛查，可以对患儿的听力进行长期监测，观察听力变化，及早发现异常。

12SrRNA基因突变的携带者，耳毒性药物可能导致其发生药物敏感性耳聋，需要禁用耳聋性药物，同时要提醒携带者，其母系亲属也应该禁用耳聋性药物，从而避免或减少药物性耳聋的发生。本次检出4例1555A＞G均质突变型和1例1555异质突变型，可明确这5例新生儿是耳毒性药物的敏感个体，应告诉监护人需要进行用药指导，新生儿以及其母系亲属应该终生禁用氨基糖甙类抗生素，从而可避免发生耳聋。药物性耳聋基因筛查，可“筛一益十”，对其所有母系亲属都有预防作用。

GJB3突变携带者为基因携带有遗传性耳聋突发病基因，如果发生高频听力损失，建议及时到医院就诊。本次检出5例为GJB3耳聋基因的携带者，GJB3基因突变主要表现为语后进行性高频感音性耳聋，这些患儿有发生迟发型听力损失的可能［6］，以上是基因筛查结果还需要结合临床表现诊断，如果临床表现为耳聋，可能还有其他致聋基因或者外来因素导致耳聋，需要进行进一步的听力学筛查，尽早明确病因，采取适当治疗手段，避免由聋致哑；如果通过常规听力学筛查，在婚育时可进行遗传咨询。

本文结果提示，在正常人群中也会携带常见的遗传性耳聋突变基因。因此，进行新生儿耳聋基因筛查，对遗传性也聋的早期发现，预防及治疗具有积极作用。

［1］ 韩德民，新生儿听力及耳聋基因联合筛查［J］．中国医学文摘耳鼻喉科学，2012，27（6）；290－292．

［2］ Valvassori GE，Clemis JD．The large vestibular aqueductsyndrome［J］．Laryngoscope．1978，88：723－728．

［3］ Emmett JR．The large vestibular aqudect syndrome［J］．Am J Otology，1985，6：387－415．

［4］ 杨伟炎，张素珍，赵承君，等．95例大前庭水管综合征的临床分析［J］．中华耳鼻咽喉科杂志，2003，38：191－194．

［5］ 汪吉宝．大前庭水管综合征［J］．中华耳鼻咽喉科杂志，2002，37：400．

［6］ 马静，林垦，毛志勇，等．中国云南地区非综合征型感音神经性耳聋GJB2和GJB3基因突变分析［J］．中国耳鼻喉颅底外科杂志，2015，21（2）：99－103．

The application of genetic deafness gene chip in screening of neonatal deafness gene

Ma Ning，YANG Xiao，PENG Wei，LI Hao，WANG Yan
DevelopmentalBiologyLaboratory，BaiyiChildren’sHospitalAffiliatedtoPLAArmyBeijingGeneralHospital，Beijing，100700

Objective：To screen common deneness gene of newborn by genetic deafness gene chip，to use the result of genetic screening to assist clinical diagnosis，and to provide genetic counseling．Methods：The heel blood of newborns were collected and made for dried blood spots，and then lymphocyte DNA was extracted from the dried blood spots．Nine mutations of four common deafness genes of Chinese were tested by Nine Deafness Gene Mutations Detection Kit，which included GJB2（35delG／176del16／235delC／299delAT），GJB3（C538T），SLC26A4（IVS7－2A＞G／A2168G）and mitochondrion 12SrRNA（A1555G／1494T）．Results：Mutations were found in 73cases，and the rate of mutation was 3．5%．Among the 73cases，28cases were mutations of GJB2gene，5cases were mutations of 12SrRNA gene，34 cases were mutations of SLC26A4gene，and 5cases were mutations of GJB3gene，1case had three heterozygous mutation （235delC heterozygous，299delAT heterozygous and IVS7－2A＞G heterozygous）．Conclusion：Normal persons maybe carry genetic deafness because of gene mutation，so deafness gene detection of newborns will help to find deafness mutation early，and it is also help for preventing and treating deafness．

Newborn；Hereditary hearing loss；Gene chip；GJB2gene；12srRNA gene；SLC26A4gene；GJB3gene

10．3969／j．issn．1004－8189．2017．09．011

2017－05－24

2017－06－09

张 璐］