氟环唑对映体绝对构型的确定及残留分析方法研究

张春艳 刘志伟 苟高章 杨倩文 施海燕 王鸣华

摘 要 采用Lux Cellulose-1手性柱，建立了氟环唑对映体的反相高效液相色谱拆分方法。采用高效液相CD检测器确定了氟环唑对映体的旋光性和流出顺序，通过比较实测圆二色光谱图与计算圆二色光谱图，确定了氟环唑对映体的绝对构型。在此基础上，建立了氟环唑对映体在蔬菜水果及土壤中的残留分析方法，系统评价了方法的精密度、准确度、灵敏度和基质效应。在优化条件下，即以乙腈-水（60∶40，V/V）为流动相、流速0.6 mL/min、柱温30℃、检测波长220 nm，实现了氟环唑对映体的基线分离。手性柱上流出的第一个峰为（S，R）-（-）-氟环唑，第二个峰为（R，S）-（+）-氟环唑。在0.1～10.0 mg/L的浓度范围内线性关系良好，无明显基质效应。氟环唑对映体在6种基质中的平均回收率在80.8%～96.7%之间，日间相对标准偏差为1.5%～6.1%， 日内相对标准偏差为1.1%～6.7%； 方法的最小检出量（LOD）为0.10～0.15 ng，定量限（LOQ）为0.05 mg/kg。本方法能满足食品和环境样品中氟环唑对映体的检测要求。

关键词 氟环唑； 对映体； 高效液相色谱； 绝对构型； 残留分析

1 引 言

随着手性技术的不断发展，手性农药已经成为手性技术发展过程中的一大亮点，国际市场中商品化的农药中有30%是手性农药[1～4]。手性农药对映体通常具有相同的物理化学性质，但当手性农药作用于生物体时，其对映体的生物活性及生物体内的吸收、分布、转换、代谢以及毒性方面往往会存在较大差异[5～8]。如在三唑醇的4个对映体中，（1S，2R）的杀菌活性最高，而（1R，2S）和（1S，2S）的活性仅为（1S，2R）的1/70[9]。Huang等[10]研究了己唑醇的两个对映体对水生生物斜生栅藻的急性毒性，结果表明（-）-对映体的毒性约为（+）-对映体的6倍。因此，从对映体水平研究手性农药的活性、毒性以及环境行为等，能更合理更准确地对其进行评价。手性化合物绝对构型的确定以及分析方法的建立是系统研究手性农药立体选择性的基础。确定绝对构型的方法主要有X射线单晶衍射法、基于手性试剂和NMR的Mosher法结合、有机合成法及光谱法等[11～14]。由于电子圆二色（ECD）光谱法对分子基团的空间取向非常敏感，能够提供手性分子的三维结构信息，目前已成为探索手性分子空间绝对构型的有力工具。

氟环唑是一种内吸性三唑类杀菌剂，能抑制病菌麦角甾醇的合成，阻碍病菌细胞壁的形成。氟环唑具有杀菌广谱、药效高、低残留、内吸性强、持效期长的特点，广泛应用于小麦、水稻、油菜、大豆、苹果、葡萄、咖啡、烟草等作物的病害防治。氟环唑分子中含有两个手性中心，存在4个对映体，但商品化的氟环唑是顺式结构，由两个对映体组成。目前有关氟环唑对映体的研究主要为手性拆分方法，残留分析方法的报道较少。Han等[15]使用Chiralcel OJ-H手性柱，在正相、反相及极性有机相多种模式下对氟环唑进行了拆分，并考察了不同流动相比例对拆分的影响； Qiu等[16]在纤维素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（Lux Cellulose-1）手性柱上用反相液相色谱基线分离了氟环唑； Tian等[17，18]建立了氟环唑在纤维素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相（CDMPC）或直链淀粉-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯） （ADMPC）上的反相液相色谱拆分方法； 赵悦臣等[19]利用超高效合相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPC2-QTOF/MS），建立了顺式-氟环唑在苹果、葡萄和茶叶中的手性对映体拆分与残留分析方法。而有关其对映体绝对构型的研究尚无报道。

本研究采用反相高效液相色谱结合Lux Cellulose-1手性柱对氟环唑对映体进行拆分，利用高效液相色谱CD检测器确定其旋光性和对映体的流出顺序，并通過比较实测和计算ECD光谱确定了氟环唑对映体的绝对构型，在此基础上，建立了氟环唑对映体在土壤、黄瓜、苹果、梨、葡萄和番茄6种基质中的残留分析方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Agilent-1200高效液相色谱仪（配VWD检测器，美国Agilent公司）； CD-2095圆二色检测器（日本Jasco公司）； J815圆二色光谱仪（日本Jasco公司）； R-200型旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）； CQ25-12D超声波清洗机（宁波江南仪器制造厂）； TDL-40B台式离心机（上海安亭仪器有限公司）； FA25匀浆机（德国Fluko公司）； MUL9000（A）-H-30型超纯水系统（南京总馨纯水设备有限公司）； Lux Cellulose-1手性色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，广州菲罗门科学仪器有限公司）； Alumina-N、Cleanert Florisil、Cleanert-NH2 固相萃取柱（天津博纳艾杰尔科技公司）。

氟环唑标准品（98.5%，上海安谱实验科技股份有限公司）； 氟环唑对映体标准品（98.0%，上海勤路生物技术有限公司）； 乙腈（色谱纯，美国Tedia公司）； 其它试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

2.2 实验方法

2.2.1 流动相比例的确定 测定氟环唑在220～400 nm范围内的吸收光谱，确定氟环唑的最大吸收波长为220 nm。利用Lux Cellulose-1手性色谱柱，在柱温30℃、流速0.6 mL/min、检测波长220 nm的条件下，考察不同流动相比例对氟环唑对映体拆分的影响。

2.2.2 氟环唑对映体流出顺序与绝对构型的确定 采用高效液相CD检测器，在优化的色谱条件下测定氟环唑外消旋体进样时两个峰的旋光性和流出顺序。

使用J815圆二色光谱仪，在室温条件下以100 nm/min的速度在200～400 nm范围内对氟环唑对映体乙腈溶液扫描，重复3次，绘制出实测圆二色光谱图（Electronic circular dichroism，ECD）。先将溶液中氟环唑对映体的优势构象进行几何优化，选用密度泛函理论（Density functional theory， DFT）B3LYP方法进行低能构象的结构优化。以对映体基态几何结构为基础，按电子吸收过程的垂直跃迁机制，利用含时密度泛函理论（Time-dependent DFT， TDDFT）中的Gaussian 09 计算方法[B3LYP/6-31+G*]，得到每个电子跃迁的激发态能量和转动速度，再根据拟合公式模拟得到计算ECD谱图，溶剂模型为乙腈PCM模型[20，21]。通过比较计算圆二色光谱和实测圆二色光谱确定氟环唑对映体的绝对构型。

2.2.3 样品提取方法 （1）黄瓜、番茄、葡萄、苹果：分别称取20 g均质样品于100 mL离心管中，加入40 mL乙腈，匀浆5 min，超声20 min，4000 r/min离心5 min，取20 mL上清液，过无水Na2SO4，浓缩近干，待净化。 （2）梨：称取20 g均质样品于三角瓶中，加入60 mL二氯甲烷，振荡1 h，抽滤，过无水Na2SO4，浓缩近干，待净化。（3）土壤：称取10 g土壤样品于50 mL离心管中，加入5 mL水和30 mL乙腈，涡旋10 min，超声20 min，再加入3 g NaCl，涡旋1 min，4000 r/min离心5 min，取15 mL过无水Na2SO4，浓缩近干，待净化。

2.2.4 净化方法 Alumina-N SPE小柱先用6 mL正己烷预淋，再用8 mL正己烷分两次溶解上样，用10 mL正己烷：丙酮（95∶5， V/V）淋洗小柱，抽干小柱，10 mL二氯甲烷-正己烷（60∶40，V/V）洗脱，收集洗脱液，45℃浓缩至干，1 mL乙腈定容，过0.22 μm有机滤膜，待测。

2.3 方法验证

2.3.1 基质效应 准确称取氟环唑外消旋体标准样品0.0102 g，用乙腈配制成1000 mg/L标准母液，再梯度稀釋成0.1～10.0 mg/L的系列标准工作溶液。根据2.2.3节和2.2.4节的提取和净化方法制备空白基质样品，分别使用0.1～10.0 mg/L标准工作溶液配制成基质标准溶液。在优化的仪器条件下进行测定，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别建立溶剂标准曲线和各基质匹配标准曲线。根据溶剂和基质标准曲线的斜率评价方法的基质效应。

2.3.2 准确度、精密度和灵敏度 在空白样品中添加3档浓度的氟环唑对映体标准溶液，添加浓度分别为0.05、0.5和1.0 mg/kg，每个添加浓度设5个重复，避光条件下放置8 h，按2.2节的方法提取净化，计算回收率，评价其准确度和精密度，并分别考察方法的日间精密度和日内精密度。

2.4 对映体分离效果评价方法

手性化合物拆分中常用保留因子（Capacity factor， k′）、分离因子（Separation factor， ɑ）和分离度（Resolution， Rs）评价分离效果，计算公式如下：

式中，t0为系统死时间，由溶剂峰测定，测定的溶液一般是磷酸二氢钾的盐溶液，t为对映体色谱峰的保留时间，t1和t2为分别为两个对映体的色谱峰保留时间，w1和w2为对映体峰宽。分离度Rs≥1.5时，两个相邻峰达到基线分离，标志着两个峰已完全分离； 当Rs<1时，两个峰之间有互相重叠的部分。

3 结果与讨论

3.1 分离条件的优化

考察了不同比例的乙腈-水对氟环唑对映体拆分的影响，分离结果如表1所示，在流速为0.6 mL/min，流动相为55%～85%乙腈的条件下，随着乙腈含量增加，保留时间逐渐缩短，t1从17.61 min减小到7.23 min， t2从30.13 min减小到9.88 min。在所有条件下，氟环唑对映体均能较好地实现分离，分离度在7.83～12.03之间。但在实际样品检测时，氟环唑对映体在乙腈-水（60∶40，V/V）中未受到杂质干扰，而在乙腈-水（70∶30，80∶20，V/V）等比例条件下，目标化合物均会受到样品杂质的干扰。 因此， 选择乙腈-水（60∶40，V/V）作为最佳流动相。此外，随着流速增加，氟环唑对映体分离度变化不大，但对映体的响应值逐渐减小，故选择流速为0.6 mL/min。

3.2 氟环唑对映体流出顺序和绝对构型的确定

采用高效液相CD检测器，在优化色谱条件下测定氟环唑外消旋体标准品的出峰顺序（图1）。结果表明，Lux Cellulose-1手性色谱柱上第一个被洗脱出的对映体为（-）-氟环唑，第二个峰为（+）-氟环唑，此流出顺序与Zhang等[22]报道的结果一致。通过比较计算和实测ECD光谱图（图2），发现二者的变化趋势一致。由此可知，图1中第一个峰为（S，R）-（-）-氟环唑，第二个峰为（R，S）-（+）-氟环唑。

3.3 前处理方法的优化

考察了乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷3种对氟环唑溶解度较高的有机溶剂对不同基质中氟环唑提取效率的影响。结果表明，乙腈为提取溶剂时，土壤、黄瓜、番茄、葡萄、苹果中氟环唑对映体的平均回收率在84.1%～91.2%之间，梨中的平均回收率低于73.8%； 二氯甲烷作为萃取剂时，梨中的添加回收率达到90.8%以上，而使用乙酸乙酯作为提取溶剂时，各种基质中氟环唑的回收率均偏低（64.2%～71.2%）。故针对不同基质，选择最适的提取溶剂，以取得较高的回收率，即土壤、黄瓜、番茄、葡萄、苹果选用乙腈作为提取溶剂，梨选用二氯甲烷作为提取溶剂。

蔬菜水果中一般含有大量色素、甾醇及糖类等杂质，会干扰目标化合物的检测。固相萃取是净化杂质常用方法之一， 本研究比较了Alumina-N、Cleanert Florisil和Cleanert-NH2 3种固相萃取柱（SPE）净化效果。Cleanert-NH2 SPE小柱先用6 ml正己烷预淋，再用8 mL正己烷分两次溶解上样，用8 mL正己烷-丙酮（95∶5，V/V）淋洗小柱，10 mL正己烷-丙酮（90∶10，V/V）洗脱小柱； Cleanert Florisil SPE小柱先用6 ml正己烷预淋，再用8 mL正己烷分两次溶解上样，用8 mL正己烷淋洗小柱，10 mL正己烷-丙酮（90∶10，V/V）洗脱小柱； Alumina-N的净化条件见2.2.4节。结果表明，Cleanert-NH2 SPE回收率较低（<60%）； Alumina-N SPE和Cleanert Florisil SPE均能达到回收率要求，而Alumina-N SPE的净化效果优于Cleanert Florisil SPE。因此，选取Alumina-N SPE作为氟环唑在各基质中的净化小柱。

3.4 基质效应

氟环唑对映体在溶剂和各基质中的回归方程和基质效应见表2。在0.1～10.0 mg/L浓度范围内，溶剂标准曲线和基质标准曲线的线性关系良好，R2>0.9998。分析结果表明，基质斜率与溶剂斜率之比在0.99～1.01之间，说明氟环唑在各基质中没有明显的基质效应，可采用溶剂标准曲线进行定量检测。 （S，R）-（-）-氟环唑的线性回归方程为y=78.829x-1.2522（R2=0.9998）； （R，S）-（+）-氟环唑的线性回归方程为y = 79.12x-1.4583（R2=0.9999）。二者的线性范围均为0.1～10.0 mg/L， 图3添加0.05 mg/kg氟环唑外消旋体的土壤样品典型色谱图。

3.5 准确度、精密度和灵敏度

氟环唑在6种基质中的添加回收实验结果（表3）表明，（S，R）-（-）-氟环唑在各基质中的平均回收率在80.8%～96.7%之间，日间相对标准偏差（RSD）为1.5%～6.1%，日内RSD为11%～62%； （R，S）-（+）-氟环唑在各基质中的平均回收率在824%～935%之间，日间RSD为27%～59%，日内RSD为22%～67%。方法的定量限（LOQ）为0.05 mg/kg，最小检出量（LOD）为0.10～0.15 ng。根据《食品安全国家标准》（GB 2763-2016），氟环唑在苹果和葡萄中的最大残留限量（Maximum residue limit，MRL）为0.5 mg/kg，本方法的LOQ为MRL值的1/10，且方法的准确度和精密度均满足农药残留试验准则（NY/T 788-2004）的相关要求，可用于实际样品的检测。与文献[22]（LOD≤1.4 μg/kg，LOQ≤4.7 μg/kg）相比，本方法灵敏度较低，但能满足实际样品的检测要求，可为氟环唑对映体选择性研究提供参考。

4 结 论

利用HPLC结合Lux Cellulose-1手性色谱柱对氟环唑对映体进行了拆分，确定了最佳拆分条件。通过高效液相CD检测器确定了氟环唑对映体的流出顺序，通过比较实测与计算ECD结果确定了氟环唑对映体的绝对构型。从手性柱上第一个被洗脱出来的峰为（S，R）-（-）-氟环唑，第二个被洗脱出来的峰为（R，S）-（+）-氟环唑。与传统的构型确定方法相比，计算化学确定手性化合物的绝对构型更加方便快捷，且具有很高的可信度和准确性[23]。在此基础上，建立了氟环唑对映体在蔬菜水果及土壤中的残留分析方法，氟环唑对映体在0.1～10.0 mg/L范围内线性关系良好，本方法无基质效应。方法的平均回收率为80.8%～96.7%，日间RSD在1.5%～6.1%之间，日内RSD在1.1%～6.7%之间； 定量限（LOQ）为0.05 mg/kg。本研究为食品和环境中氟环唑对映体的定量测定提供了一种快速、准确的方法，为系统评价手性杀菌剂氟环唑的立体选择性和安全性提供了参考。

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