基于脂质代谢组学研究重离子束辐射诱导的酿酒酵母线粒体损伤

张苗苗 郭晓鹏 刘瑞媛 马良 高越 陆栋 李文建

摘 要 采用超高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱（UHPLC-ESI-MS）技术，结合多元变量及单变量的数据分析方法，研究了重离子束辐射后线粒体受损的酿酒酵母（ResD-4）的脂质代谢组学。检测了对照组（Control）及ResD-4的脂质代谢物组成，共鉴定出648种脂质分子。研究结果表明，正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）能准确区分ResD-4与Control的脂质代谢物；通过变量权重值（VIP）、变异倍数（FC）、差异性（p）分析相结合，最终筛选出甘油二酯（DG）（16∶0/18∶1）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）（18∶0）、溶血磷脂乙醇胺（LPE）（16∶0）、溶血磷脂酰肌醇（LPI）（18∶0）、溶血磷脂酰丝氨酸（LPS）（18∶0）、磷脂酸（PA）（16∶0/18∶0）、磷脂酰胆碱（PC）（31∶0）、磷脂酰乙醇胺（PE）（16∶0/10∶0）、磷脂酰肌醇（PI）（15∶0/18∶0）、磷脂酰丝氨酸（PS）（16∶0/16∶0）、硫代异鼠李糖甘油二酯（SQDG）（37：4）和硫代异鼠李糖甘油二酯（SQDG）（15∶0/16∶0/18∶0）共12个亚类、54种显著性差异脂质分子； 显著性差异脂质分子表达量分析显示，ResD-4中DG、TG、SQDG、PA、PC、PI、LPC、LPE、LPI的表达量上调，PE、PS、LPS的表达量下调。根据上述实验结果，推测酿酒酵母可能通过调节脂质成分的含量来应对重离子束辐射引起的线粒体损伤，显著性差异脂质分子可能是重离子束辐射诱导酿酒酵母线粒体损伤后的潜在标志物。

关键词 脂质组学； 重离子； 线粒体损伤； 酿酒酵母； 超高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱

1 引 言

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为酵母种属中最重要的一类，具有结构简单、易于培养、生长代谢快、 兼具真核生物的分子基础和遗传学特性等特点，已成为收集真核细胞生物信息的主要模式生物[1]。随着高通量测序技术的发展，研究人员破译了酵母全基因组信息后[2]，对酵母的研究重点从获得其全部遗传信息逐渐转移到解析遗传信息所表征的生物学功能方面，由此促进了蛋白质组学和代谢组学的迅速发展。2003年Han和Gross提出了脂质组学（Lipidomic）的概念[3]。 脂质组学属于代谢组学中的一个分支，是对生物体整体脂质进行分析的一门新兴学科[4]。目前， 脂质组学检测一般采用色谱-质谱联用及直接进样质谱技术两大类，分析方法包括非靶向分析[5]和靶向[6]分析两类。非靶向分析也称为全脂分析，能够对样本中各类型脂质及其代谢物进行无偏向地系统性解析，从中筛选生物标志物。基于非靶向脂质组学分析平台，可结合LipidSearchTM软件进行脂质鉴定与数据预处理，LipidSearchTM是细胞脂质识别和相对定量的有力工具，该软件中收录了8大类、300种亚类、约170万种脂质分析的MS2及MS3数据库，本研究主要使用LipidSearch software version 4.1对采集到的图谱数据进行分析处理。

与哺乳动物细胞及其它微生物相比，酵母脂质组简单，脂质代谢调控基因和结构比例较高，磷脂及麦角固醇等脂质类生物合成代谢途径清晰明确[7，8]。近年来，酵母脂质组学研究主要集中在生物标志物及生物过程优化等方面。例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇和磷脂酸可作为呋喃、苯酚、醋酸耐受酵母的生物标志物[9]； 對22株工业酿酒酵母的发酵参数及脂质组进行关联研究，发现酵母乙醇产量低与早期较高水平的磷脂酰肌醇有关，乙醇产量高与磷脂酰胆碱有关[10]。酵母脂质组学的研究已扩展到酵母不同生长阶段脂质变化的灵活性、酵母细胞膜和完整线粒体脂质检测等多个方面。如Klose等[11]发现，在酵母的整个生长阶段，甘油三酯（TG）的含量一直呈稳定增加趋势，对数生长中期TG的含量是早期的两倍； 而磷脂酰肌醇（PI）在对数生长中期的含量比早期下降了75%，磷脂酰胆碱（PC）的含量在整个生长周期中未发生明显变化。Blagovic′等[12]对比分析了啤酒酵母细胞膜和线粒体脂质的组成，发现PI在细胞膜、PC在线粒体中的含量最高，分别占37%和30%，细胞膜中性脂质的含量是线粒体的2倍多，并且这两种细胞器中的脂肪酸以不饱和脂肪酸为主，棕榈酸是其主要成分。Angelini等[13]采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）技术，以Tetra-myristoyl-CL（14∶0）为内标，量化了野生酵母及两株心磷脂（CL）缺陷型酵母完整线粒体脂质的含量，建立了一种心磷脂检测的技术方法。以上研究分别对酵母生长过程、 细胞膜及线粒体的脂质进行了检测分析，但是酵母线粒体损伤如何影响细胞脂质代谢的研究还未见报道。电离辐射产生的大量自由基对细胞线粒体造成损伤后[14]，可能会引起包括三羧酸循环和脂质代谢在内的碳代谢途径发生变化。重离子束是重离子加速器将大量的比α粒子重的离子加速到很高的速度（甚至接近光速）形成的带有能量的射线[15]，重离子束辐射作为一种高线性能量转移辐射，作用于生物体时产生大量自由基，会造成单个碱基替换、DNA双链断裂和团簇损伤[16]，也会引起活细胞线粒体局部膜电位快速消失[17]、酵母细胞膜通透性改变等生物现象[18]。Cao等[18]以酿酒酵母为研究对象，发现重离子束辐射会导致酵母细胞膜通透性和完整性发生不可逆的改变，并且细胞膜通透性的增加以及酯酶活性的下降与辐射剂量具有显著相关性。本研究针对重离子束辐射对酿酒酵母线粒体损伤后脂质代谢轮廓进行研究，应用统计分析方法筛选出差异性显著的脂质代谢物，结合代谢通路分析了线粒体损伤后酿酒酵母脂质变化的机理。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

重离子加速器（中国科学院近代物理研究所， 中国科学院兰州重离子加速器国家实验室）； UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色谱仪（日本SHIMADZU公司）； Q-Exactive Plus质谱仪（美国Thermo公司）； ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱（100 mm× 2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司）； 5430R低温高速离心机（德国Eppendorf公司）； MP Fastprep-24匀浆仪器（美国MP Biomedicals公司）； BILON-1000Y超声仪（上海比朗仪器制造有限公司）； 恒温摇床（上海一恒科学仪器有限公司）。

乙腈、异丙醇和甲醇（色谱纯，美国Thermo公司）； 甲基叔丁基醚（Methyl Tert Butyl Ether，MTBE，分析纯，美国Sigma-Aldrich公司）； 甲酸铵（质谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）； YPD培养基：1%酵母膏（生物试剂，英国OXOID公司）、2%蛋白胨（生物试剂，中国北京奥博星生物技术有限责任公司）、2%葡萄糖（分析纯，中国天津市大茂化学试剂厂）溶于水后，121℃高压灭菌20 min，冷却后备用； 实验用水为Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）制备的超纯水。

2.2 实验方法

2.2.1 酿酒酵母样品前处理及收集 酿酒酵母BY4743（Saccharomyces cerevisiae BY4743），购于美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC），为对照组（Control）。使用中国科学院近代物理研究所重离子加速器国家实验室提供的能量为80 MeV/u的碳离子束对Control样本进行辐射处理，辐射剂量分别为90、120、150 Gy。以酵母2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）反应无显色、菌落形态变小、对数期生长时间倍增为筛选依据，90Gy时筛选得到两株线粒体受损的酵母ResD-1、ResD-2，120 Gy时筛选得到两株线粒体受损的酵母ResD-3和ResD-5，150 Gy时筛选得到一株线粒体受损的酵母ResD-4。Control和ResD-1、ResD-2、ResD-3、ResD-4、ResD-5分别接种于YPD培养基中，30℃、200 r/min培养至OD600=0.55（对数期）时收集酵母菌体，PBS溶液清洗两次后的菌体沉淀，先液氮冰浴，再保存在80℃冰箱备用。每组样本制备6个生物学重复样品。

2.2.2 脂质代谢物提取 （1）脂质代谢物的提取[19] 分别取100 μL解冻后的Control及ResD-1、ResD-2、ResD-3、ResD-4、ResD-5样本于10℃ 5000 g 离心5 min后收集菌体沉淀，再分别加入200 μL纯净水混匀，匀浆2次再加入240 μL预冷甲醇及800 μL MTBE涡旋混合，冰水浴中超声20 min，室温静置30 min，于10℃、14000 g离心15 min，取上层有机相后氮气吹干； 质谱分析前，所有样品加入200 μL异丙醇溶液复溶并涡旋，离心除去不溶物后再进行检测。（2）质量控制（Quality control，QC）样品的制备称取等量Control、ResD-1、ResD-2、ResD-3、ResD-4、ResD-5酵母样本混合均匀后，按照上述样品处理过程处理，所得代谢提取物作为质量控制样品。

2.3 UHPLC-ESI-MS分析条件

2.3.1 色谱条件 流動相A为含10 mmol/L甲酸铵的乙腈-水（60∶40， V/V）， 流动相B为含10 mmol/L甲酸铵的乙腈-异丙醇（10∶90， V/V）。洗脱梯度： 0～7 min，30% B； 7～25 min，30%～100% B； 25～30 min， 30%B。柱温45℃， 流速300 μL/min， 进样量2 μL。

2.3.2 质谱条件 分别采用电喷雾电离（ESI）正、负离子模式采集数据。正、负离子扫描模式参数设置为：气化温度300℃，鞘气流速45 arb，辅助气流速15 arb，吹扫气流速1 arb； 正、负离子喷雾电压分别设为3000和2500 V； 毛细管温度350℃； 正、负离子S透镜放射频率分别为50%和60%； 正、负离子一级质谱扫描范围分别为m/z 200～1800和m/z 250～1800； 在m/z 200 时，一级质谱和二级质谱分辨率分别为70000和17500。

2.4 数据处理

采用LipidSearch software version 4.1（Thermo ScientificTM， America）软件对采集到的LC-MS原始数据进行峰识别、脂质鉴定（二级鉴定）、峰提取、峰对齐、定量等处理。所得数据经过总峰面积归一化并删除组内缺失值>50%的脂质分子， 处理后的数据导入SIMCA-P（Version 14.1， Umetrics， Sweden）， 经Pareto-scaling预处理后依次进行以下分析： （1）UHPLC-ESI-MS分析系统的稳定性，（2）正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA），（3）脂质分子单变量统计分析：变异倍数（Fold change， FC）及差异性（p），（4）显著性差异脂质分子表达量分析。筛选差异脂质的标准为：FC>2.0或<0.5且p<0.05； 筛选显著性差异脂质的标准为：变量权重值（Variable importance for the projection， VIP）>1， p <0.05， FC>2.0或FC<0.5。

3 结果与讨论

3.1 UHPLC-ESI-MS分析系统的稳定性

分析系统稳定性是获得实验可靠性数据的前提，本研究在正、负离子模式下检测了6株酵母（Control、ResD-1、ResD-2、ResD-3、ResD-4、ResD-5）36个样品的脂质代谢物，每8个样品设置1个QC样品，共设置了5个QC样品评价分析系统的稳定性。5个QC样品在正、负离子模式下的超高效液相色谱-轨道离子阱质谱基峰图（UHPLC-Obitrap MS BPC）如图1所示，QC样品各色谱峰的响应强度和保留时间重现性良好，说明分析系统稳定，获得的实验数据可靠，满足脂质代谢组学分析要求。

脂质组学的非靶向分析要求尽可能获得所有脂质的信息。本研究采用LipidSearch software version 4.1软件对正、负离子模式下ResD-1、ResD-2、ResD-3、ResD-4、ResD-5/Control酵母脂质代谢物进行初步统计分析后发现，ResD-4/Control的差异脂质分子种类最丰富，所以后续研究主要针对ResD-4/Control的脂质代谢物结果进行详细分析讨论。如图2所示，ResD-4中共鉴定出的脂质分子有648种，涉及25个亚类，而这25个亚类又分别归于脂肪酸类（FA）、甘油脂类（DG、TG）、鞘脂类（Cer、CerG1、SM、So）、糖脂类（MGDG、SQDG）、甘油磷脂类（CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS）等主要脂质大类[20]。

3.2 正交偏最小二乘判别分析

正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）是一種对偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进行修正的分析方法，可以滤除与分类信息无关的噪音[21]，提高模型的解析能力和有效性。本研究中，OPLS-DA作为一种监督式投影方法，通过7次循环交互验证，使Control和ResD-4样品在数据集中实现最大分离（图3A和3B）。基于UHPLC-ESI-MS分析检测技术，ResD-4/Control的648种脂质分子的OPLS-DA模型得分图见图3A，预测主成分t[1]反映了组间差异最大化，正交主成分反映了组内变异； 图3B显示了ResD-4/Control的OPLS-DA模型的置换检验图，Q2表示模型预测能力，Q2越大，表示模型的预测能力越好； R2Y表示模型解释率，R2越大表示解释能力越强[22]； 在正、负离子模式下，R2Y=0.999，Q2=0.994，R2Y和Q2都大于0.9，表明模型解释能力和预测能力较好，说明检测到的648脂质分子能准确实现Control 和ResD-4样本的组间区分。此外，根据OPLS-DA模型得到VIP值，在后续分析中用于显著性差异脂质的筛选。

3.3 脂质分子单变量统计分析

潜在差异脂质标志物的筛选是脂质代谢组学研究的重要部分，单变量统计分析方法可直观有效的筛选潜在差异脂质标志物。图4是ResD-4/Control脂质数据分析后的火山图，横、纵坐标分别代表脂质代谢物在两组间FC值的log2FC和p值的lgp，图中脂质数据基本呈正态分布，

红色方形点显示部分是ResD-4/Control之间存在的差异脂质。在差异脂质基础上，根据OPLS-DA模型得到变量权重值（VIP），结合FC及p值，以VIP>1且p<0.05且FC>2.0或<0.5为标准筛选出54种显著性差异脂质分子[23]，各脂质分子结构、分子式等参数详见表1。表1中包括2个甘油二酯（DG）、2个溶血磷脂酰胆碱（LPC）、2个溶血磷脂乙醇胺（LPE）、1个溶血磷脂酰肌醇（LPI）、1个溶血磷脂酰丝氨酸（LPS）、1个磷脂酸（PA）、7个磷脂酰胆碱（PC）、5个磷脂酰乙醇胺（PE）、2个磷脂酰肌醇（PI）、5个磷脂酰丝氨酸（PS）、1个硫代异鼠李糖甘油二酯（SQDG）、25个硫代异鼠李糖甘油二酯（SQDG）。TG作为酵母细胞中重要的储能和供能脂肪，占总显著性差异脂质分子的46.3%，由此可见，重离子束辐射损伤酿酒酵母线粒体后，脂肪代谢途径受到的影响较为明显。

FC是代谢物浓度在两组中的均值之比[24]，显著性差异脂质分子FC的log2FC可直观判断脂质分子表达量的变化情况，log2FC>0，表示脂质分子表达量升高； log2FC<0，表示代谢表达量降低。从表1中log2FC值可见，SQDG、PI、PA、LPI、LPE、LPC、DG及TG的表达量升高，PE、LPS的表达量下降，PS的表达量以下降为主，表达量升高的显著性差异脂质分子占总显著性差异脂质分子的79.6%。以上变化说明，重离子束辐射诱导的酿酒酵母线粒体损伤，会导致酵母脂质代谢途径发生紊乱。

3.4 显著性差异脂质分子表达量分析

相同亚类脂质中各显著性差异脂质分子表达量差异明显，而柱状图分析可直观的表示脂质代谢物表达量的变化情况。如图5所示，ResD-4/Control中DG、TG、PA、PC、PI、LPC、LPE、LPI、SQDG表达量升高，PE、PS、LPS表达量下降。在酿酒酵母脂质生物合成过程中，DG是脂质分子合成的重要前体物质，代谢途径多样，可通过甘油二酯途径合成TG，也可在二酰甘油激酶（Dgk1）的作用下合成PA[25]，PA在磷脂酸磷酸水解酶（Pah1）、二酰甘油焦磷酸磷酸水解酶（Dpp1）共同作用下也可分解代谢生成DG。PA在CDP-二酰甘油合成酶（Cds1）作用下生成胞苷二磷酸-甘油二酯（CDP-DG）[26，27]， 该物质在磷脂酰肌醇合成酶（Pis1）和磷脂酰丝氨酸合成酶（Pss1）作用下合成PI和PS[28]。在ResD-4中，PI表达量升高，PS表达量下降，说明在以CDP-DG为底物时，PI的合成途径优先于PS进行。

PC和PE在酵母膜脂质中含量较高，线粒体能自主合成一部分PE，而PC则直接依赖于外部输入[29，30]。PE可通过线粒体上的磷脂酸丝氨酸脱羧酶（Psd1）合成[31]，其连续甲基化后可合成PC[32]。ResD-4是线粒体受损的酵母，PE在线粒体中的合成受阻是造成PE下降的主要原因，当PE连续甲基化合成PC的途径未被阻断时，也可能造成PE表达量的下降。

LPC、LPE 、LPI、LPS都属于溶血磷脂，是PC、PE、PI和PS被磷脂酶A等水解而成。在本研究中， LPC、LPI随PC、PI的升高而升高，LPS随PS的降低而降低，LPE与PE变化趋势相反。LPE在三酰甘油脂肪酶（Tgl3）和溶血磷脂酰基转移酶（Ale1）共同作用下合成PE，Ale1位于线粒体-内质网结构偶联处，Tgl3主要定位在脂滴上[33，34]，在LPE表达量升高时，PE表达量降低，说明辐射影响了酵母线粒体和内质网发生交互作用的功能平台及脂滴的正常功能，导致LPE合成PE的代谢途径受阻。SQDG属于糖脂类，常见于植物或藻类叶绿体内的类囊体膜上，在植物光合作用效率、适应生态条件改变等方面起着非常重要的作用[35，36]。与光合作用有关的色素分布在叶绿体类囊体上，而与有氧呼吸相关的脂质、蛋白质大部分位于线粒体膜上，从生物学功能来说叶绿体和线粒体都是能量转换器，共同参与自然界中的碳循环，所以SQDG在酿酒酵母中的检出也预示了糖脂类与线粒体功能活动密切相关。

4 結 论

利用UHPLC-ESI-MS技术结合多变量和单变量数据分析手段，研究了酿酒酵母Control和线粒体受损酵母ResD-4的脂质代谢组学，共鉴定出54种具有显著性差异的脂质代谢标志物。脂质分子表达量结合代谢通路分析表明，重离子束辐射引起的酵母线粒体受损会导致脂质代谢异常，说明酵母线粒体功能与脂质代谢密切相关。重离子辐射是一种高效的诱变技术，与X射线、γ射线等常规的物理诱变技术相比，重离子束辐射会导致生物体DNA出现更多的双链断裂和团簇损伤，导致更多新的生物性状产生，因此，重离子束辐射技术被广泛用于微生物、植物等的诱变育种。利用重离子束辐射筛选突变体，研究辐射产生的生物学效应，对于揭示电离辐射对生物体的损伤、修复机理以及各种代谢途径的改变具有重要意义。

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