比例电化学传感器在生化分析中的研究进展

崔琳 李萌 邹笑然 张春阳

摘 要 电化学传感器具有简便、快速、灵敏、成本低、易于微型化、可在线检测等优点，在疾病诊断、环境监测和食品安全领域得到广泛应用。然而，传统的电化学传感器存在稳定性差和重现性差等不足。比例电化学传感器基于一对双信号转换模式，以两种或两种以上电化学活性分子的电信号比值作为输出信号。由于同一体系中的两种或多种电活性物质的电信号常会受到相似的外界环境影响，采用比值作为输出信号能够在一定程度上消除来自体系本身和背景的电化学信号的潜在干扰，提供内部自校准，提高检测灵敏度和选择性。本文主要综述了比例电化学生物传感器的构造策略及其在蛋白质、核酸、生物小分子和金属离子检测等生化分析中的研究应用进展，对该领域未来的发展趋势和应用前景进行了展望。

关键词 比例电化学生物传感器； 超灵敏检测； 生化分析； 评述

1 引 言

电化学传感器是以离子导电为基础的一种分析检测装置。作为一种非机械式传感装置，电化学传感器主要利用与目标分子间的特异性识别作用准确感应生物或化学目标，通过使目标分子在传感器内部发生电化学反应，导致被测分子消耗或产生一定量的电活性物质，在基础电极的转化传导下，将目标物的反应信息通过电信号的方式有序地输出，从而实现分析检测功能。电化学传感器具有选择性好、操作简单、成本低廉、便于携带及不破坏测试体系、不受颜色影响等优点[1，2]，在临床医学诊断、药物和食品分析及环境检测等领域得到广泛应用。电化学传感器通常由敏感识别元件、信号转换元件和检测元件三部分组成。常用的识别元件为生物材料，信号转换元件为电极，电势、电流或电导等作为检测信号。基于特定的生物分子识别机制，固定在电极表面上的生物分子（例如抗原、抗体、激素和酶等）可将目标分子捕获至电极表面[3～6]。在外加电压的作用下，该识别过程伴随着电子转移进行，并导致电化学信号（例如电压、电流和阻抗等）的变化[7～9]。根据电化学生物传感器在构建过程中有无标记，可将其分为标记型电化学生物传感器和无标记型电化学生物传感器。无标记型电化学生物传感器具有无需标记、操作方便和假信号率低等优势，但其检测灵敏度较低，不利于生物分子的灵敏检测。标记型电化学生物传感器的标记过程相对复杂繁琐，但其灵敏度相对较高。然而，传统的单标记传感器存在着制约其发展的固有缺陷。首先，单一标记存在灵敏度低的问题，对于超痕量检测无能为力； 其次，由于单标记是“一对一”的电信号输出模式，假阳性和假阴性识别都可能会引发信号改变，从而无法对信号进行甄别。

与传统的单一电信号输出的电化学生物传感器相比，比例电化学传感器可利用两种电活性物质在不同电位产生电信号，实现在同一传感体系中的双信号响应，采用双重信号的比例强度进行分析可有效避免固有背景产生的电化学信号的潜在干扰。因此，比例电化学传感器对来自系统本身或背景的电信号影响具有内置校正能力，显示出较高的灵敏度和选择性。具有高选择性和高灵敏度的比例电化学传感器是一种理想的分析工具，可在复杂的检测系统中实现目标物的高选择性和稳定性分析[10～14]。比例电化学传感器通常需要选择两种或两种以上的电活性分子产生电信号，通过分析不同电位下两种电活性分子产生电信号的比值，实现其分析检测功能。通常使用的电活性分子有亚甲基蓝（MB）、二茂铁（Fc）和硫堇（Thi）等。近年來，大量研究工作致力于发展双信号传感模式（即比例电化学传感）， 包含双信号或多信号模式的多种比例电化学传感器的相继成功构建，使比例电化学传感器在化学和生物传感领域得到越来越多的关注，并展现出广阔的发展前景[15～20]。本文系统总结了比例电化学传感器的制备策略及其在蛋白质[21～29]、核酸[30～41]、生物小分子[42～56]、金属离子[57～67]等分析研究中的应用，并对比例电化学传感器的发展前景进行了展望。

2 比例电化学传感器的制备策略

比例电化学生物传感器根据电化学信号峰值强度的比值检测分析物，在一定程度上提高了检测灵敏度和选择性。根据电化学信号和被分析物的关系，可将比例电化学生物传感器的制备策略分为两类：内置参比信号的比例电化学传感策略和双重参比信号的比例电化学传感策略。对于传统的单信号传感策略（图1A），其电信号随分析物浓度的变化呈单一变化。而对于双信号传感策略（即比例电化学传感策略）（图1B），既可设计仅有一个电化学信号依赖于分析物含量、另一个电化学信号与分析物的含量无关的内置参比信号比例电化学传感器，又可构建两个电化学信号均取决于分析物含量的双重参比信号比例电化学传感器。

2.1 内置参比信号的比例电化学传感

利用内置参比信号传感策略构建的比例电化学传感器具有灵敏度高、检出限低、不易受外界环境因素干扰等特点，目前已被广泛用于生物传感领域。通过引入氧化还原活性物质（如MB、Fc和Thi）作为内置参比，可消除来自仪器设备、检测环境、样品本身的干扰因素。在应用内置参比信号传感策略制备比例电化学生物传感器的过程中，可使用不同的电化学检测方法或信号转导模式，但要保证内置参比信号的强度在分析物浓度发生变化的情况下保持恒定。采用响应信号与内部参比信号峰值强度比作为分析物的测量标准，可有效减少在电化学传感过程中由微环境和其它因素引起的误差，提高比例电化学生物传感器的灵敏度、重复性和准确性[15]。Luo等[58]设计了一种内置参比信号比例生物传感器，用于检测活大鼠脑中Cu2+和γ-半胱氨酸（CySH）的含量（图2）。该检测系统主要由金纳米叶修饰的碳纤维微电极（CFME）以及能与Cu2+特异结合的N，N-2-吡啶基乙二胺（DPEA）组成。金纳米叶的修饰可显著提高系统的比表面积和电催化性能。MB修饰的核苷酸序列作为内参照物，可抑制来自脑组织中其它生物分子与离子的干扰。首先与DPEA结合的Cu2+在特定电压下显示一个峰值电流密度，该峰值随Cu2+浓度增加而增大。CySH的加入将导致Cu2+与其发生络合并与DPEA分离，引起峰值降低。在此过程中，作为内置参比的MB的修饰核酸序列始终在另一电压下具有恒定的峰值电流密度。在人工脑脊液（aCSF）中，根据不同浓度下的Cu2+与内参比分子的峰值电流密度比值，可得到Cu2+的线性检测范围为1～14 μmol/L，检出限可达320 nmol/L，此外，根据不同浓度下的CySH与内参比分子的峰值电流密度比，得到CySH的线性检测范围为1～12 μmol/L，检出限为 480 nmol/L。Cai等[21]利用电极表面修饰的聚硫堇-金（PTh-Au）产生的电信号作为内置参比信号，电解液中K3[Fe（CN）6]产生的电信号作为检测信号，制备了一种比例电化学免疫传感器。该传感器可实现对肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）的灵敏检测，检测范围为0.005～40 ng/mL，检出限为2.2 pg/mL。当CEA通过免疫反应固定在修饰电极上时，将阻碍K3[Fe（CN）6]在电极上的电子传递，使检测信号发生改变，而PTh-Au产生的参比信号在合适的电解液pH值下始终保持恒定。通过分析检测信号与恒定的内参比信号之间的比值可准确检测CEA浓度。

2.2 双重参比信号的比例电化学传感

双重参比信号的比例电化学生物传感构造策略主要基于目标分子被识别前后两种电活性标记物与电极表面的距离改变导致电化学信号的变化。这种传感策略不仅能够提高检测的灵敏度，还可避免一些与分析物无关（如电极面积变化、目标分子非特异性吸附等）的干扰。利用电极表面两种电活性分子电信号变化的比值作为输出信号，可减小复杂样品带来的信号波动，提高重现性与稳定性。目前，该传感策略已广泛应用于蛋白质[22～29]、核酸[30～41]、金属离子[57～67]以及其它生物小分子[43～56]的分析检测。

3 比例电化学生物传感器的分析应用

3.1 检测蛋白质

目前，比例电化学传感器已成功用于肿瘤标志物CEA[21]、前列腺特异抗原（PSA）[23]、凝血酶[22，27]、朊病毒蛋白[25]以及其它蛋白酶[23，24，26～28]的检测，显示出高选择性、高灵敏度、低检出限及良好的稳定性。Gao等[22]设计了一种双信号比例电化学适配体传感器，通过靶标催化循环杂交自组装对凝血酶进行检测（图3）。该传感器含有两个DNA发夹结构：H1和H2。其中，发夹结构H1的3′端修饰有Fc且具有一段凝血酶适配序列，在无凝血酶存在下该适配序列与结构中另一段互补序列配对形成发夹结构。发夹结构H2的3′端标记有MB且具有一段和H1序列互补的序列。他们首先将发夹结构H2修饰在电极上，使MB靠近电极表面，产生较强的电化学信号。由于H1含凝血酶适配序列，靶蛋白凝血酶的加入能打开H1发夹结构，暴露出H1中与H2序列互补的部分，促进H1与电极表面H2的杂交。H2可通过DNA分支迁移将靶蛋白从H1上置换释放，使Fc分子靠近电极表面而MB分子远离电极表面，最终导致MB和Fc电化学信号的改变。释放的靶标蛋白可继续打开另一个H1，触发上述循环过程。该双信号比例适配传感器利用IFc/IMB作为响应信号，展现较高的灵敏度和重复性，检测范围为0.1 pmol/L～10 nmol/L， 检出限为41 fmol/L。该传感器对靶蛋白凝血酶具有高选择性。当体系同时存在多种类似生物分子（如免疫球蛋白G（IgG）、三磷酸腺苷（ATP）和人血清白蛋白（HSA））时，凝血酶的测定不受干扰。Ren等[23]发展了可一步测定蛋白质生物标志物的比例电化学传感策略。该方法将Fc标记的发夹DNA固定在金电极表面以获得传感界面。在MB标记的DNA-抗体1（DNA1-Ab1）和DNA2-抗体2（DNA2-Ab2）两种探针存在的情况下，靶蛋白的加入可诱导两种探针之间的夹心免疫反应，引发DNA1和DNA2的杂交，打开电极表面的发夹DNA，在传感界面上形成三臂DNA结构。这种DNA组装导致Fc离开电极、MB接近电极，引起Fc和MB电信号变化，产生可测量的比例电化学信号。该传感器检测PSA的检出限为4.3 pg/mL，线性检测范围为0.01～200 ng/mL。通过改变亲和性探针链接的抗体，该方法可进一步用于其它抗原检测。

Yu等[25]基于靶蛋白调控的主客体竞争策略，构建了可检测朊病毒蛋白（Prion）的比例电化学生物传感器（图4）。他们利用β-环糊精（β-CD）和MB间的主客体相互作用，将带有MB标记的朊病毒蛋白适配体（MB-Apt）引入到多壁碳纳米管-β-环糊精（MWCNTs-β-CD）复合物修饰的玻碳电极上。在无朊病毒蛋白存在时，位于β-CD内腔的MB-Apt被羧酸二茂铁（FCA）置换，从而将FCA引入电极表面，产生较大的FCA氧化峰电流。在朊病毒蛋白存在时，朊病毒蛋白与其适配体MB-Apt相互作用形成封闭β-CD内腔的生物门（Biogate），阻碍FCA通过客体置换作用进入β-CD内腔，导致MB的氧化峰电流增大、FCA的峰电流减小，引起相应的比例电化学信号变化。该传感器对靶蛋白具有较好的选择性，检出限可达160 fmol/L。

3.2 检测核酸

核酸检测在重大疾病的早期诊断、预后判断及环境监测等方面发挥着十分重要的作用。比例电化学生物传感器可实现对核酸的简单、快速、超灵敏检测[30～41]。Cui等[30]发展了一種基于DNA四通结构（DNA-4WJ）及酶辅助循环放大的比例电化学生物传感器（图5）。该传感器主要由一个组装到金电极表面的三链分子信标（THMB）和两条未经修饰的辅助DNA序列（α序列和β序列）组成。THMB由MB标记的发夹探针（HP）和Fc标记的核苷酸序列（UT）组成，并经UT固定于电极表面。HP的发夹结构使MB靠近电极表面并产生强的电化学信号，而UT构型的展开则导致Fc远离电极表面产生弱的电化学信号。由于在两条辅助DNA（α序列和β序列）中各含有一段HP的互补序列和一段目标DNA的互补序列，目标DNA和两条辅助DNA可与HP杂交形成DNA-4WJ结构，破坏THMB结构，并导致MB远离电极表面和MB电化学信号降低、Fc靠近电极表面和Fc电化学信号增大，从而引起MB与Fc的比例电化学信号变化。通过RNase HII对DNA-4WJ结构进行酶切，可释放HP和辅助DNA序列，引发下一轮循环，实现酶辅助的信号循环放大。该比例电化学传感器制备简单，灵敏度高，检测范围为0.1 pmol/L～100 nmol/L，检出限可达0.063 pmol/L。另外，DNA-4WJ结构的引入可保证该传感器对目标DNA具有较高的选择性。

miRNA与肿瘤等疾病的发生和发展密切相关，是临床诊断的重要生物标志物。Zhang等[32]开发了一种基于两足DNA“步行者”（DNA walkers）的比例电化学生物传感器，用于检测癌细胞外泌体中的miRNA-21。该DNA“步行者”由两部分“足”序列和一部分“体”序列组成，并通过“体”序列与连接于磁珠上的互补DNA链杂交。其行走轨道是修饰于电极表面的MB标记的发夹DNA（MB-H1）。miRNA-21的存在可释放磁珠上的DNA“步行者”，该“步行者”沿着DNA轨道持续行走，将MB-H1发夹结构打开并暴露其粘性末端。当加入Fc标记的发卡DNA（Fc-H2）时，通过粘性末端介导的链置换反应（TMSDR）与MB-H1杂交形成双链，释放DNA“步行者”并启动下一循环。多次循环导致电极表面Fc含量增加，电流信号增大，而作为内置参比信号分子的MB与电极距离不变，电流信号不变。该方法通过测量电流信号比率可实现对miRNA的灵敏检测，检测范围为0.1 fmol/L～100.0 fmol/L，检出限可达67 amol/L，可用于乳腺癌细胞系和血清中miRNA-21的检测。Yuan等[33]提出了基于双链特异性核酸酶（DSN）双信号放大的比例电化学传感器用于检测miRNA。他们将Fc标记的发夹捕获探针（CP）固定在Au电极上以获得传感界面。目标miRNA与CP杂交并打开CP的发夹结构，形成miRNA-DNA双链。DSN可特异性剪切miRNA-DNA双链中的DNA链，释放目标miRNA，并引发下一轮剪切过程，导致大量Fc随DNA链的剪切而离开电极表面，Fc电信号减小。电极上剩余的DNA片段可作为杂交链反应（HCR）的引物，在另外两条DNA单链（HDNA和HDNA′）存在下捕获含有Thi的AuNPs连接的DNA（DNA/Au NPs/Thi），形成双链DNA聚合体，导致大量Thi聚集于电极表面，Thi电信号增大。该方法通过分析Fc和Thi电流比例值（IThi/IFc）的变化，可选择性检测miRNA-141，检测范围为0.1 fmol/L～100.0 pmol/L，检出限可达11 amol/L。

3.3 检测生物小分子

生物小分子（如抗坏血酸（AA）、双酚A（BPA）、腺苷、H2O2、H2S等）在人体新陈代谢和生命活动中起着非常重要作用，与人类健康密切相关[42～56]。抗坏血酸是人体必不可少的营养素，同时也是体内的抗氧化剂，可保护人体免受自由基的威胁，在多种生理和病理过程中起关键作用[42，54]。Wang等[42]将金属有机骨架材料（PCN-333（Al），PCN代表多孔配位网络）用于比例电化学生物传感器的构建，并将其应用于抗坏血酸（AA）的检测（图6）。他们将AA的催化剂科琴黑（Ketjenblack，KB）和作为内参比信号分子的Thi包封到PCN-333（Al）的孔洞中，并将PCN-333（Al）修饰于玻碳电极上。PCN-333（Al）中的KB可催化氧化AA，产生氧化峰电流，而Thi所产生的内置参比信号不变，因而利用两者间电流比率可实现对AA的灵敏检测。该生物传感器检测范围为14.1～5.5 mmol/L（R2=0.998），检出限为4.6 mmol/L。 PCN-333（Al）的多孔结构可有效固定KB和Thi，避免了KB和Thi在电极表面的粘附或聚集，提高了传感器的稳定性。同时，PCN-333（Al）可选择性地将目标分析物积累到孔中，提高检测选择性。

Cui等[45]发展了一种基于MB与交替的AT碱基序列间的相互作用的比例电化学传感器，并将其应用于生物小分子腺苷的检测（图7）。他们将一条DNA链1作为捕获探针并固定于金电极表面，在该链的近3′端胸腺嘧啶（T）碱基处修饰MB。同时设计另一条3′端标记有Fc的适配体链用于识别腺苷。在无腺苷存在时，这两条DNA链部分互补配对，导致MB远离电极表面、Fc接近电极表面，产生较小的峰值电流比（IMB/IFc）。值得注意的是，造成较小IMB/IFc值的原因包括：（1）MB与电极表面间距离增大； （2）MB与聚（T-A）双链结构相互作用导致其电子转移速率下降。当腺苷存在时，其与Fc标记的适配体链形成G-四连体结构，导致适配体链离开电极表面、Fc远离电极表面、MB接近电极表面，产生较大的IMB/IFc值。该方法通过对IMB/IFc值的分析可灵敏的检测腺苷，检出限可达90.8 pmol/L，检测范围为0.1 nmol/L～100 μmol/L。

過氧化氢（H2O2）是一种多功能的生物标志物，广泛参与到酶催化、细胞信号传导等过程。H2O2是活泼的羟基自由基（·OH）的前体，而·OH与其他活性氧（ROS）物种被认为与引发各种疾病的氧化应激过程有关[50]。Goggins等[50]设计合成了硼酸酯-二茂铁衍生物作为H2O2探针，该探针在电压为0.05 V时显示一个氧化峰电流。H2O2能氧化该探针并促使硼酸酯水解脱落，得到氨基二茂铁，导致0.05 V电压处硼酸酯-二茂铁衍生物的氧化电流峰降低，0.2V电压处氨基二茂铁的氧化峰电流出现并逐渐增大。通过检测氨基二茂铁与硼酸酯-二茂铁衍生物的峰电流并计算其转化率，可实现对H2O2的比例电化学检测，线性检测范围为0～800 μmol/L。

硫化氢（H2S）是生物系统中的气体递质，具有调节心血管、神经元和免疫系统的作用。H2S水平异常与多种疾病（例如慢性肾脏疾病、肝硬化和唐氏综合征）相关。Manibalan等[51]设计合成了两种含有叠氮引发基团和报告基团的H2S探针（叠氮基苄基二茂铁氨基甲酸酯（ABFC）和N-烷基叠氮基苄基二茂铁氨基甲酸酯（NABFC）），实现了对活细胞释放的H2S的实时定量检测。在无H2S时，两种探针均在0.23V电压下具有峰电流。H2S可特异性地触发两种探针释放报告基团：氨基二茂铁（FA）和N-烷基氨基二茂铁（NFA），这两种报告基团分别在0.06 V和0.1 V电压下产生新的峰电流。该方法通过分析峰电流比率信号，可特异的检测H2S，两种探针的检出限分别为0.32 μmol/L（10.6 ppb，ABFC）和0.076 μmol/L（2.54 ppb，NABFC）。

3.4 检测金属离子

金属离子（如Cu2+、Cd2+和Hg2+等）的精确测定在生物学、医学、环境和化学等领域非常重要[57～67]。环境中潜在的Hg2+能对生理系统造成严重损害，并引起多种急性和慢性疾病[15]。Jia等[57]开发了一种基于Y型-DNA结构的比例电化学传感器，并将其应用于检测Hg2+（图8）。他们利用标记有MB和Fc的DNA探针形成Y-型DNA结构并将其固定在金电极表面。由于Fc靠近电极，MB远离电极，可得到明显的Fc强信号和MB弱信号。Hg2+可与Y-型DNA结构中的T-T错配碱基对形成稳定的T-Hg2+-T复合物，将Y型-DNA结构转化为发夹结构。在转化过程中，MB靠近电极表面、MB峰电流增大，Fc远离电极表面、Fc峰电流减小。他们用方波伏安法（SWV）检测Hg2+，检测范围为1 nmol/L～5 mmol/L，检出限为0.094 nmol/L。Hg2+与T-T错配碱基对之间的特异性结合保证了该生物传感器的良好选择性。利用L-半胱氨酸与Hg2+配位作用，可恢复电极表面的Y型-DNA结构，使传感器再生。

Cu2+参与调节骨形成、细胞呼吸和结缔组织发育等生理过程[59～63]，高浓度的Cu2+对生物组织具有毒副作用。Yu等[59]利用双羟基官能团化的聚离子液体（DHF-PIL）为催化剂基底构建了比例电化学生物传感器，并将其应用于检测鼠脑中的Cu2+。DHF-PIL的大孔结构为生物分子的充分负载提供了高表面积。他们通过静电相互作用将内置参比信号分子2，2′-氮杂双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐）（ABTS）及Cu2+特异性识别分子神经激肽B（NKB）修饰到DHF-PIL。NKB可特异性的结合Cu2+形成[CuII（NKB）2]复合物，并产生Cu2+的氧化峰电流，而内参比ABTS在整个过程中峰电流强度不变。该传感器应用微分脉冲伏安法（DPV）分析Cu2+与ABTS峰电流的比率，对Cu2+的检出限为0.24 μmol/L，线性检测范围为0.9～36.1 μmol/L。该传感器具有较高的选择性，能抵御大脑中可能存在的一系列干扰物质（如金属离子（Ca2+、Fe3+、Mg2+、Na+等）、氨基酸（Cys、Phe、Met、Gly等）、内源性化合物（抗坏血酸、多巴胺、尿酸、葡萄糖、乳酸等））对检测结果的干扰。

4 總结与展望

比例电化学生物传感器对来自系统或背景电信号的影响有内置校正能力，能够克服传统的单信号电化学传感器的局限性（例如灵敏度较低、“假阳性”或“假阴性”信号等），具有较高的检测准确度和灵敏度。本文系统综述了比例电化学生物传感器的两种制备策略：内置参比信号的比例电化学传感策略和双重参比信号的比例电化学传感策略及其在生化分析领域中的应用。目前，比例电化学生物传感器已成功应用于分析检测蛋白（凝血酶）[22，27]、核糖核酸（DNA[30，31，34，35，38，39]、miRNA[32，33，36，37]），抗原（CEA[21]、朊病毒[25]等）、生物小分子（抗坏血酸[41，54]、CySH[58]、双酚A[43，44]、腺苷[45]、DOX[46]、葡萄糖[50，53，55]、H2O2[50]、H2S[51]等）和金属离子（Hg2+[57]、 Cu2+[59～63]、 Cd2+[64]）等。随着对比例电化学生物传感器研究的深入，未来有望开发出一系列可用于肿瘤标志物（例如α-胎儿蛋白质、CA125抗原、鳞状细胞癌相关抗原、前列腺特异性抗原、神经元特异性烯醇酶或人绒毛膜促性腺激素）、生物小分子和生物毒性离子（例如Pb2+和Ag+等）检测的比例电化学生物传感器。值得注意的是，比例电化学生物传感器仍然存在着以下问题：（1）可标记信号分子种类有限； （2）标记成本较高。因此，开发成本低廉、简单易得、功能多样的比例电化学生物传感器将成为未来该领域发展的重点。目前比例电化学传感器的发展主要呈现出以下趋势：

（1）发展新型无标记的比例电化学传感模式。通过纳米材料包覆电化学活性分子或者利用生物分子原位生长纳米材料的方法，发展无标记、低成本、高灵敏度的比例电化学传感器。

（2）构建便携式比例电化学生物传感仪器。结合丝网印刷等技术，有望实现比例电化学传感器的小型便携化，推动比例电化学生物传感器的商业化。

（3）开发多功能比例电化学生物传感器。在一个传感系统中应用双重或多重比例电化学信号传感模式进行双重/多重生化分析。

（4）比例电化学技术与其它技术（例如拉曼光谱、气相色谱和质谱等）相结合，将比例电化学的应用范围拓展至活体分析和在线分析。

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