薄层色谱和高效液相色谱用于矮地茶多糖的单糖组成分析

肖作奇+文晓柯+潘涛

[摘要] 目的 分析矮地茶多糖中的单糖组成及摩尔比值。 方法 采用硫酸水解多糖，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色谱法和薄层色谱法同时分析矮地茶多糖的单糖组成和摩尔比，Agilent TC-C18色谱柱，流动相：乙腈-pH为7.0的磷酸缓冲液（20∶80，0.1%），检测波长：250 nm，流速：1 mL/min；柱温：25℃。 结果 薄层色谱法和高效液相色谱法结果皆表明矮地茶多糖由葡萄糖（Glu）和半乳糖（Gal）组成，高效液相色谱法显示矮地茶多糖中Glu和Gal的摩尔比值约为1∶2.36。 结论 薄层色谱法可用于矮地茶多糖的单糖组成的快速鉴别，方法快速、准确；高效液相色谱法可用于矮地茶多糖中单糖组成的鉴别和摩尔比值测量，方法简单、灵敏、分离效率高。

[关键词] 矮地茶；多糖；高效液相色谱；薄层色谱；单糖组成

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）10（c）-0130-04

[Abstract] Objective To analyze the monosaccharide composition and the molar ratio of Ardisia japonica Polysaccharide （AJP）. Methods Sulfuric acid was used to hydrolyze AJP. Pre-column 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazalone （PMP） derivation HPLC and TLC method were developed to determine the monosaccharide compositions and the molar ratio of AJP. The mobile phase was acetonitrile-pH 7.0 phosphate buffer （20∶80， 0.1%） with Agilent TC-C18 column. The detection wavelength was 250 nm， the flow rate was 1 mL/min， and the column temperature was 25 ℃. Results The results of TLC and HPLC analysis showed that AJP were consisted of glucose （Glu） and galactose （Gal）. Meanwhile， HPLC analysis showed that the molar ratio of AJP was 1∶2.36. Conclusion TLC which is fast and accurate， can be used for the rapid identification the monosaccharide composition in AJP. HPLC which is simple， sensitive and high separation efficiency， can be used for the quantitative analysis of the monosaccharide composition in AJP.

[Key words] Ardisia Japonica； Polysaccharide； HPLC； TLC； Monosaccharide Composition

矮地茶是紫金牛科植物Ardisia japonica（Thumb.） Blume的干燥全草，收录于《中国药典》2015年版[1]，具有止咳平喘、清利湿热、活血化瘀的功效。现代研究证明，矮地茶水提取物具有良好的止咳、抗病毒、抗乙肝等生物活性[2-4]，其中主要化学成分除了内酯类（岩白菜素）、黄酮（槲皮素）等成分外[5-8]，还含有大量的多糖成分，多糖可能是矮地茶潜在的药效成分之一。同时，越来越多的中外学者认为植物多糖是天然药物中的主要药效成分[9-10]。目前，关于矮地茶多糖的研究报道非常少，对多糖的单糖组成进行研究是多糖结构和生物活性深化研究的前提，基于此，笔者采用水提取、多次醇沉得到矮地茶多糖（AJP），用硫酸对AJP进行水解，参照相关文献[11-20]，采用薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）两种方法对矮地茶多糖中单糖组成和摩尔比进行分析，为矮地茶多糖的深入研究提供基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

电子分析天平（Mettler Toledo XS205型，德国，d=0.01 mg），超声清洗器（上海科导，HS-2060），色谱柱（安捷伦TC-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm），薄层层析硅胶（硅胶G板，10 cm×20 cm，中国青岛海洋化工集团公司），0.22 μm微孔滤膜（针式滤器，上海安谱科学仪器有限公司），高效液相色谱仪（日本岛津，LC-20A型），柱温箱（日本岛津，CTO-10AS），二极管阵列检测器（日本岛津，SPD-M20A）。

1.2 药品和试剂

水（娃哈哈纯净水），乙腈（Tedia，美国，色谱纯）。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，P109105-100 g，批号：L1401046）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；葡萄糖（Glu，10010518，批号：20150630）、木糖（Xly，63012034，批号：20151010）、鼠李糖（Rha，63010234，批号：20150526）、果糖（Fru，63003034，批号：20150505）和半乳糖（Gal，63004434，批号：20141211）对照品购于国药集团化学试剂有限公司。矮地茶药材购自湖南省衡东县中药饮片厂（批号：20141026），药材经湖南中医药大学附属二医院王竹鑫主任药师鉴定为正品。其他试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 矮地茶多糖的制备

取矮地茶药材粉末100 g，加入1.5 L水，90℃水浴提取1 h，过滤；滤渣再次加入1.5 L水，90℃水浴提取1 h，过滤，合并两次滤液，浓缩至200 mL；加入无水乙醇使醇浓度达到80%，4℃静置6 h，过滤，取滤渣；滤渣再次加入200 mL水溶解，加入无水乙醇使醇浓度达到80%，4℃静置6 h，过滤，取滤渣，即得AJP。经苯酚-硫酸法测定，AJP糖纯度为96.8%。

2.2 试剂配制

2 mol/L的硫酸溶液：取850 mL水加入1L容量瓶中，量取109 mL浓硫酸沿着容量瓶壁缓慢加入，放冷至室温，加水定容，摇匀，即为2 mol/L的硫酸溶液。0.2 mol/L的氢氧化钠溶液：精密称取8.00 g氢氧化钠于1 L容量瓶中，加水定容，摇匀，即得。4 mol/L的氢氧化钠溶液：精密称取16.0 g氢氧化钠于100 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，即得。0.1 mol/L的盐酸溶液：量取9.0 mL浓盐酸于1 L容量瓶中，加水定容，摇匀，即得。0.5 mol/L的PMP溶液：精密称取PMP 8.80 g于100 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

标准单糖溶液配制：分别称取Gal（23.93 mg）、Rha（22.01 mg）、Fru（20.82 mg）、Xly（24.44 mg）和Glu（23.47 mg）于5 mL容量瓶中，加水定容，即得单糖标准品溶液。另取各种单糖于同一5 mL容量瓶中，加水定容，即得混合标准品溶液。

2.3 矮地茶多糖的水解

取矮地茶多糖约50 mg于具塞试管中，加入2 mL 2 mol/L的硫酸溶液80℃水浴水解2 h。水解完成后，加2 mL 4 mol/L的氢氧化钠溶液，转移至10 mL容量瓶，加少量水洗具塞试管两次，洗液也转移至同一容量瓶，加水定容，即为AJP水解液，备用。

2.4 TLC分析

取硅胶板105℃下活化30 min，取单糖标准品溶液和矮地茶多糖水解液点样，点样顺序为Fru、Rha、Xly、Glu、Gal、AJP、AJP，点样体积为5 μL。两次展开，展开剂1∶正丁醇∶丙酮∶水体积比=4∶3∶1；展开剂2∶正丁醇∶乙酸乙酯∶异丙醇∶水体积比=8∶4∶7∶3。先用展开剂1展开至10 cm高度，取出晾干，再用展开剂2展开至10 cm高度，取出，晾干。显色剂为2%二苯胺丙酮溶液∶2%苯胺丙酮溶液∶85%磷酸体积比=5∶5∶1。显色条件为置105℃烘箱中加热30 min。拍照记录，结果见图1。结果显示，AJP水解产物与Glu和Gal在相同位置显示相同颜色斑点，在其余位置无斑点，表明AJP由Glu和Gal组成。

2.5 单糖对照品和样品衍生化

分别精密量取单糖标准品溶液（Fru、Rha、Xly、Glu、Gal）、混合标准品溶液和AJP水解液100 μL放入编号的7支具塞试管中，进行PMP衍生。步骤为：加入0.2 mol/L的NaOH水溶液500 μL，再加入0.5 mol/L的PMP溶液500 μL，混合均匀，在80℃水浴反应1 h，反应结束后取出试管与自来水中冷却至室温，再加入0.1 mol/L的HCl水溶液1000 μL中和反应液中的NaOH。用2 mL氯仿萃取三次，除去反应剩余的PMP，取水层溶液过0.22 μm微孔滤膜，即得衍生化样品，供HPLC分析用。

2.6 色谱条件

色谱柱：C18，进样量：10 μL，流动相：乙腈-pH为7.0的磷酸缓冲液（20∶80，0.1%），检测波长：250 nm，流速：1 mL/min；柱温：25℃，分析时间35 min。色谱图见图2。

2.7 线性关系考察

TLC结果表明，AJP中仅含有葡萄糖和半乳糖两种单糖，所以该研究仅对葡萄糖和半乳糖的线性关系进行考察。分别取葡萄糖单糖标准液0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL于1 mL容量瓶中，加水定容至1 mL，按“2.5”项下条件衍生化，同法制备半乳糖不同浓度衍生化样品。衍生化后进行HPLC分析，记录峰面积，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。葡萄糖和半乳糖线性方程分别为：Y=2697.63X-28.69（r2=0.999 8）和Y= 3057.15 X - 56.83 （r2=0.999 5），线性范围分别为：0.045～2.235 μg和0.046～2.279 μg。

2.8 精密度试验

取经过衍生化后的单糖对照品溶液，按“2.6”项下条件连续进行6次HPLC分析，记录峰面积，葡萄糖和半乳糖的RSD分别为0.9%和1.0%，说明仪器精密度良好。

2.9 稳定性试验

取AJP水解液PMP衍生化后的溶液，分别于放置0、2、4、6、12、24 h时后，按“2.6”项下色谱条件进行HPLC分析，记录峰面积。统计结果显示，葡萄糖和半乳糖RSD分别为1.5%和1.1%，证明AIP水解液衍生化后在24 h内稳定性好。

2.10 重复性试验

精密称取同一批次AJP样品6份，每份约50 mg，按“2.3”项下条件水解，按“2.5”项下条件衍生化，按“2.6”项下色谱条件进行HPLC分析，记录峰面积，计算样品中葡萄糖和半乳糖含量。结果显示葡萄糖和半乳糖含量RSD分别为1.7%、1.9%，表明方法重复性良好。

2.11 加样回收试验

精密称取同一批次已知葡萄糖和半乳糖含量的AJP样品6份，每份约25 mg，按表1中的量加入葡萄糖和半乳糖标准物质，按“2.3”项下条件水解，按“2.5”项下条件衍生化，按“2.6”项下色谱条件进行HPLC分析，记录峰面积，计算加样回收率，结果表明方法加样回收率符合含量测定要求。见表1。

2.12 矮地茶多糖中单糖组成分析

分别按上述方法测定三批AJP样品的单糖组成，计算结果表明AJP由葡萄糖和半乳糖组成，三批次摩尔比分别为1∶2.36、1∶2.32、1∶2.40，平均值为1∶2.36。

3 讨论

笔者考察了三氟乙酸、盐酸、硫酸等三种酸溶液对矮地茶多糖进行水解，发现三氟乙酸水解不完全，而盐酸水解条件不易控制，所以选择效果最佳的硫酸溶液，通过优化发现，2 mL 2 mol/L的硫酸溶液80℃水浴2 h能完全将矮地茶多糖水解，且不会出现碳化现象。同时，本研究对PMP衍生条件进行优化，发现温度过高或过低都会导致衍生产物HPLC峰面积降低，80℃下衍生1 h以上能达到最大峰面积[21-33]。

通过TLC和HPLC两种方法对矮地茶多糖中的单糖组成进行测定，结果显示，矮地茶多糖由葡萄糖和半乳糖两种单糖组成。TLC方法简单快捷，可用于多糖中单糖组成的快速鉴别，操作简单，对仪器依赖程度低，但其缺点是不能进行单糖摩尔比值等定量分析。HPLC方法操作相对较复杂，需经过衍生化后才能进行检测，但方法灵敏度高，分析单糖组成复杂的多糖其结果更加准确、可靠，同时可用于单糖摩尔比值等定量分析。

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（收稿日期：2016-07-20 本文编辑：赵鲁枫）