复方石斛饮品及其主要原料对α-葡萄糖苷酶抑制活性的体外研究

林清英* 林 真 林 娴 高 晖

（福建生物工程职业技术学院，福建 福州 350002）

复方石斛饮品为我院自主研发产品，是以铁皮石斛为主要原 料，配伍桑叶、桑椹等多味中药，经提取、纯化、配置而成的一种功能性饮品，具有滋阴清热、养胃生津、益气作用，可用于肺胃阴虚，津亏烦渴，内热消渴等证，也可作为糖尿病患者日常饮品，具有辅助降血糖作用。有关铁皮石斛、桑叶、桑椹等各组方原料的降血糖研究多有报道，为有效评价复方石斛饮品的降血糖作用，探讨其降糖机制，本研究建立了体外α-葡萄糖苷酶抑制活性评价体系，并对复方石斛饮品、铁皮石斛、桑叶、桑椹抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用进行了比较，为复方石斛饮品及铁皮石斛等原料的开发应用提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器：UV 2000紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）；TDL-5M台式大型冷冻离心机（湖南湘仪仪器有限公司）；DK-98-ⅡA恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药：复方石斛饮品（学院自制）；铁皮石斛（由福建省武平县梁野山种植基地提供）；桑叶、桑椹（陕西聚善堂中药材实业有限公司）；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）（美国Sigma公司）；阿卡波糖（BJ35878，中国北京拜耳医药保健有限公司）；其他试验试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 反应溶液制备

2.1.1 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）：取K2HPO415.292 g、KH2PO49.118 g，加超纯水溶解，定容至1000 m L容量瓶，混匀，即得（0.067 mol/L）。

2.1.2 α-葡萄糖苷酶溶液：精密称取α-葡萄糖苷酶0.02 g，用磷酸盐缓冲液定容至10 m L容量瓶中，混匀，即得（2 mg/m L）。

2.1.3 pNPG溶液：精密称取pNPG 0.0274 g，用磷酸盐缓冲液定容至10 m L容量瓶，混匀，即得（2.74 mg/mL）。

2.1.4 Na2CO3终止剂：取Na2CO310.6 g，加磷酸盐缓冲液溶解，定容至500 mL容量瓶中,混匀，即得（0.2 mol/L）。

2.2 抑制剂贮备溶液制备

2.2.1 复方石斛饮品：量取复方石斛饮品适量，浓缩至100 m L，低温（4 ℃）冷冻离心10 min（5000 r/min），上清液活性炭脱色，即得（250 mg/m L）。

2.2.2 铁皮石斛药材：称取新鲜铁皮石斛（含水率为67.5%）25 g，切段，加入20倍量水榨汁提取10 m in，200目滤布挤压过滤，滤渣加入5倍量水煎煮提取2次，每次1 h，合并榨汁液和两次煎煮液，600目滤布挤压过滤，滤液浓缩至100 m L，低温（4 ℃）冷冻离心10 m in（5000 r/min），上清液活性炭脱色，即得（250 mg/mL）。

2.2.3 桑叶、桑椹：分别称取桑叶、桑椹各25 g，加入多倍量水（桑叶40倍量、桑椹20倍量），浸渍0.5 h，煮沸提取2次，每次1 h，合并提取液，600目滤布过滤，滤液浓缩至100 m L，低温（4 ℃）冷冻离心10 min（5000 r/min），上清液活性炭脱色，即得（250 mg/m L）。

2.3 抑制剂对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定：利用α-葡萄糖苷酶抑制剂能抑制α-葡萄糖苷酶催化pNPG水解产生pNP的性质，以PNPG为底物，以一定时间内反应体系释放出来的pNP的量来计算抑制剂对α-葡萄糖苷酶抑制活性。反应体系（总体积5 m L）：准确移取磷酸盐缓冲液600 μL至试管中，加待测抑制剂样品溶液、α-葡萄糖苷酶溶液各100 μL，混匀，37 ℃温孵15 min，加入底物pNPG溶液100 μL启动反应，37 ℃催化水解20 min，加入Na2CO3终止剂4 m L终止反应，振荡混匀，于400 nm处测定在抑制剂作用下水解产物pNP的吸光度值，每个样品同时做3个平行样，取平均值。同时设立阴性对照（不加抑制剂，补充缓冲液），背景对照 （不加α-葡萄糖苷酶溶液，补充缓冲液），空白对照（不加底物和抑制剂，补充缓冲液），计算抑制率。

抑制率（%）＝{[（A阴性－A空白）－（A试样-A背景）]/（A阴性-A空白）}×100%。

2.4 抑制剂及其质量浓度对α-葡萄糖苷酶活性的抑制影响：取250 mg/mL的各抑制剂贮备溶液，加水稀释成浓度分别为2.5 mg/m L、10 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mL的系列样品溶液，同时取阿卡波糖适量，制成相应浓度系列的阿卡波糖阳性对照液，按照上述“2.3”方法进行α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定，绘制抑制率曲线，计算IC50。结果见表1、图1，显示，各抑制剂均有α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制活性作用强弱顺序为：桑叶＞桑椹＞复方石斛饮品＞铁皮石斛。质量浓度50 mg/L时，桑叶、桑椹水提液抑制率分别为88.2%、80.6%，均高于阳性对照阿卡波糖69.3%的抑制率，复方石斛饮品抑制率为56.4%，铁皮石斛水提液抑制率最低，为38.2%。高质量浓度150 mg/L时，桑叶、桑椹水提液抑制率分别为91.5%、90.3%，阿卡波糖抑制率为85.1%，复方石斛饮品抑制率为83.3%，铁皮石斛水提液抑制率为58.4%。

表1 不同抑制剂对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度

图1 不同抑制剂质量浓度/抑制率曲线

3 讨 论

3.1 α-葡萄糖苷酶抑制剂通过可逆性抑制小肠刷状缘的α-葡萄糖苷酶的活性，有效调节餐后血糖水平[1]，有助于控制糖尿病及其并发症的发生和发展。4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）法[2]为是α-葡萄糖苷酶抑制剂有效体外筛选方法，被广泛用于降糖中药的筛选评价。本试验参照朱文佳[3]等所建立方法，对反应体系中温孵时间、水解时间、酶浓度、底物浓度、终止剂浓度等因素进行了考察，确定温孵时间为15 m in、酶催化水解反应时间为20 m in、α-葡萄糖苷酶浓度为2 mg/m L、底物pNPG浓度2.74 mg/m L、Na2CO3终止剂浓度为0.2 mol/L。

3.2 铁皮石斛为兰科石斛属植物，以新鲜或干燥茎入药，为常用珍贵药材。具有益胃生津，滋阴清热等功效，药理研究表明其有增强免疫力、抗氧化、降血糖等作用。复方石斛饮品是根据中医药组方原则，结合现代药理研究，将铁皮石斛与桑叶、桑椹等降糖中药的有机配伍，生产加工而成。本试验对不同质量浓度的复方石斛饮品及其主要原料铁皮石斛、桑叶、桑椹水提液进行了对α-葡萄糖苷酶的抑制活性测定，结果表明，各抑制剂均有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且抑制活性强度随着样品质量浓度的升高而增大，在高浓度时，抑制率曲线趋于平缓。铁皮石斛对对α-葡萄糖苷酶抑制活性表现较弱，有关研究表明铁皮石斛主要降糖机制可能是促进胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰岛α-细胞分泌胰高血糖素，抑制肝糖原分解和促进肝糖原合成[4]。复方石斛饮品半数抑制浓度为41.5 mg/L，当质量浓度达150 mg/L时，复方石斛饮品抑制率为83.3%，其对α-葡萄糖苷酶抑制活性效果接近阿卡波糖，提示复方石斛饮品在高浓度时能明显抑制α-葡萄糖苷酶活性，达到降血糖作用。因此，铁皮石斛及其制剂降血糖效果可采用体外α-葡萄糖苷酶抑制活性评价体系进行初步评价后，可进一步采用动物试验等进行综合评价。

[1]顾觉奋,陈紫娟.α-葡萄糖苷酶抑制的研究及应用[J].药学进展,2009,33(2):62-67.

[2]Chapdelaine P,Tremblay RR,Dube JY.P-n-itophenol-α-D-glucopyranoside as substate for measurement of maltase activity in human semen[J].Chinical chemistry,1978,24(2):208-211.

[3]朱文佳,寇自农,张曦,等.α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选方法的研究[J].食品研究与开发,2012,33(8):171-175.

[4]汤志远,周晓宇,冯健,等.铁皮石斛多糖降血糖作用研究.南京中医药大学学报,2016,32(6):566-570.