新发睾丸决定基因SRY突变导致46,XY性发育异常三例

王 曦，聂 敏，刘兆祥，茅江峰，伍学焱

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 协和转化医学中心 内分泌科国家卫计委内分泌重点实验室，北京 100730)

研究论文

新发睾丸决定基因SRY突变导致46,XY性发育异常三例

王 曦，聂 敏，刘兆祥，茅江峰，伍学焱*

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 协和转化医学中心 内分泌科国家卫计委内分泌重点实验室，北京 100730)

目的在46,XY性发育异常疾病(46,XY DSD)患者中进行SRY突变检测，分析其发生频率，并总结检出SRY突变患者的临床特点。方法纳入2009-2014年在北京协和医院内分泌科就诊的46,XY DSD患者63例，收集详细临床资料，提取外周血基因组DNA，PCR特异性扩增SRY并进行Sanger测序，通过与在线数据库比对确定突变，分析临床特点。结果63例患者中共有三例检出SRY的3种新突变(约5%)。这三例患者社会性别均为女性，染色体核型为46,XY，有阴道和子宫结构，性激素符合高促性腺激素性性腺功能减退症。3种突变分别为：Pro131His、R76C和L35Afs*25。前2种错义突变位点位于HMG box核定位信号区，累及高度保守氨基酸，后1种为移码突变导致HMG box缺失，均严重破坏了SRY蛋白的重要功能结构域。结论该研究发现的3种SRY新突变是导致46,XY DSD的病因，SRY突变的检出率约为5%;对于46,XY DSD患者，建议均行SRY检测以明确病因。

SRY；性腺发育不良；性发育异常疾病

46,XY性腺发育不良(gonadal dysgenesis，GD)属于46,XY性发育异常疾病(disorder of sex development，DSD)，是由于原始性腺分化异常最终形成无功能的条索性腺，即完全性性腺发育不良(complete gonadal dysgenesis，CGD)，或形成功能不良的睾丸，即部分性性腺发育不良(partial gonadal dysgenesis，PGD)。虽然很早就提出睾丸决定因子的存在，但直到1990年才明确了首个睾丸决定基因SRY[1]。随后在人体内证实了多个与性腺分化相关的基因，包括RSPO1、SOX9、NR5A1/SF- 1、WT1、NR0B1/DAX1、WNT4和DHH等。

在所有46，XY GD患者中，SRY突变者占10%～15%[2]，而在携带有SRY的46, XX个体，性腺可分化为睾丸，即睾丸DSD[3]，说明SRY对于睾丸分化有关键作用。SRY位于Y染色体，含有1个外显子。SRY突变导致的CGD患者，由于性腺不能分泌雄激素和抗副中肾管激素，故分化形成女性内、外生殖系统，多因原发闭经就诊，激素检查符合高促性腺激素性性腺功能减退症。其性腺往往在盆腔中，恶变风险明显增加。本研究拟在46,XY DSD患者中进行SRY突变检测，分析其发生频率，并总结检出SRY突变患者的临床特点，为临床诊疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 对象

本研究选取了2009-2014年就诊于北京协和医院内分泌科的63例46, XY DSD患者。该研究符合人体试验伦理学标准，并得到中国医学科学院北京协和医院伦理委员会的批准，患者监护人已签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料收集：收集患者的初诊年龄、社会性别、雌和孕激素替代、月经情况、家族史、外生殖器、盆腔超声、性腺手术和病理。

1.2.2 激素检测方法：用Beckman UniCel DxI 800全自动化学发光免疫分析仪，检测血清雌二醇(estrodiol，E2)、总睾酮(total testosterone，T)、硫酸脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate，DHEAS)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)水平；放射免疫法检测17α-羟孕酮(17α-hydroxyprogesterone，17α-OHP)水平(DSL公司)。

1.2.3 DNA提取和SRY突变检测：在遵循知情同意原则的基础上，收集患者外周血样本2 mL/人(EDTA真空抗凝采血管)，于-80 ℃冻存备用。基因组DNA提取采用德国Qiagen公司全血DNA提取试剂盒。应用Sanger测序(PCR扩增)检测SRY基因碱基序列。使用引物设计软件Oligo 7.0和GeneRunner(Version 3.05)进行PCR引物设计，经NCBI Blast确保引物高度特异性(表1)。

1.2.4 错义突变致病性预测：用国际上公认的蛋白功能预测软件SIFT(http:// http://sift.jcvi.org/)、Polyphen- 2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org/)对错义突变进行蛋白功能预测分析。

表1 SRY的PCR扩增引物序列Table 1 Primer sequences of PCR amplification of SRY

2 结果

63例46, XY DSD患者中共有三例检出SRY突变(约5%)。

病例一于11岁曾有两次月经来潮，间隔1个月，量少。此后闭经，16岁起接受雌和孕激素替代治疗，有规律阴道流血，就诊前1年停用。就诊时26岁，查体为女性外阴，阴毛1期。性激素结果符合高促性腺激素性性腺功能减退，盆腔超声性腺显示不清，行手术探查并切除性腺，病理为条索性腺，术后继续雌和孕激素治疗。SRY检测结果为错义突变c.392C>A(p.Pro131His)，保守性分析软件预测为致病突变。

病例二因原发闭经就诊，5年前曾接受雌和孕激素治疗3个月，有月经来潮，后自行停用。就诊时25岁，查体为女性外阴，阴毛1期。性激素结果符合高促性腺激素性性腺功能减退，盆腔超声性腺显示不清，拒绝行性腺切除手术。SRY检测结果为错义突变c.226C>T(p.Arg76Cys)，保守性分析软件预测为致病突变。

病例三表现为原发闭经，18岁至就诊时(22岁)接受雌和孕激素治疗，有规律的阴道流血。查体阴毛5期，阴蒂直径1 cm。性激素结果符合高促性腺激素性性腺功能减退，伴高雄激素血症。促肾上腺激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、DHEAS和17α-OHP结果可除外肾上腺来源高雄激素血症。盆腔超声疑似双侧卵巢回声，拒绝行性腺切除。SRY检测结果为移码突变c.103_106delCTTT(p.Leu35Alafs*25)，Mutation Taster软件预测为致病突变。

上述三例患者的临床资料(表2)各异，既往体健，无类似家族史。常规检查和肝肾功能正常，外周血染色体核型均为46,XY。SRY测序(图1)均发现突变，功能预测(表3)和保守性分析(图2)提示为致病突变。

3 讨论

SRY位于Yp11.3，包含1个外显子，基因产物SRY蛋白是由204个氨基酸构成的转录因子，包含1个位于中央的由80个氨基酸组成的HMG(high-mobility-group) box区域以及两端的侧翼区[4]。

本研究纳入的3个突变均为既往未报道过的新突变。病例一和病例二均为错义突变， 分别位于HMG box内C端和N端的核定位信号(nuclear localization signal，NLS)区，此区域对SRY蛋白核转运有重要作用[5]。这两个位点氨基酸在多个物种中均十分保守，蛋白预测软件的结果均支持其为致病突变。病例3为移码突变，导致HMG box区域完全缺失。文献中报道过的无义突变分散在整个SRY中，而错义突变集中于HMG box区，且此区域氨基酸序列高度保守，说明HMG box是SRY蛋白功能的关键区域。现已证明部分位点氨基酸的改变会影响SRY蛋白的DNA结合能力(V60L、R62G、I68T、R75N、L94P、G95R、K106I、Y127C、M64I、I90M、S91G、P125L和A113T)、DNA弯曲能力(M64I)或对两方面都有影响(R62G, M78T)[6]。故本研究中的3种突变均对SRY蛋白的功能产生较大影响，为致病突变。

表2 三例患者的临床资料Table 2 Clinical data of the 3 cases

*Reference value of follicular phase in women of childbearing age.

A.case 1；B.case 2；C.case 3图1 三例患者SRY测序图Fig 1 SRY sequencing results of the 3 cases

case123SRYmutationtypemissensemissenseframeshiftSRYnucleotidechangec.392C>Ac.226C>Tc.103_106delCTTTSRYaminoacidchangep.Pro131Hisp.Arg76Cysp.Leu35Alafs*25SIFTprediction(+)(+)Polyphen-2prediction(+)(+)MutationTasterprediction(+)(+)(+)

A.case 1；B.case 2图2 2例SRY错义突变位点所编码氨基酸在不同哺乳动物间的保守性分析

本研究中病例一虽有短暂的“月经初潮”，但临床上未见男性化，且性腺病理证实其并无内分泌功能，符合CGD诊断。病史中的出血可能并非月经来潮。病例2符合典型的CGD临床表现。病例3还同时存在高雄激素血症，符合PGD表现。但其SRY为移码突变，HMG box完全缺失，预测SRY蛋白功能受损严重。且文献中所报道的SRY突变所致的PGD，其突变位点多在3’侧翼区[7]，因此临床表现与突变类型不符。猜测存在体细胞嵌合体的可能，即单侧性腺内存在携带野生型SRY的细胞，分化出少量睾丸组织。因DHEAS不高，可基本除外肾上腺疾病[8]。性索间质肿瘤可分泌雄激素，但与46,XY GD患者发生的生殖细胞肿瘤并非同类。因患者拒绝行性腺探查和切除术，故未能明确。

46,XY性腺发育不良患者的治疗除了性激素替代(根据社会性别选择)以外，对于性腺位于盆腔内者，由于其恶变率高达15%～35%[9]，恶变发生的高峰在青春期或青春期后[10]，故所有患者均建议行性腺切除。本研究中仅病例一行性腺切除，其余二例仍需在随访中警惕恶变风险。

本研究的不足和局限性：1)未能从分子水平证实基因突变对蛋白功能即对下游基因转录的影响。2)病例3雄激素水平升高的原因有待明确。

总之，SRY是性别决定的经典基因之一，SRY突变是导致46,XY DSD的较常见原因。本研究总结了三例SRY突变导致的46,XY DSD，均为新发突变，在既往文献中未见报道。对于临床符合46,XY DSD的患者，均建议行SRY检测明确诊断。后续治疗需警惕性腺恶变风险，故性腺探查和手术切除是改善预后的重要治疗。

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Three cases of novelSRYmutations causing 46,XY disorder of sex development

WANG Xi, NIE Min, LIU Zhao-xiang, MAO Jiang-feng, WU Xue-yan*

(Dept. of Endocrinology, Translational Medicine Center, Peking Union Medical College Hospital, CAMS & PUMC,Key Laboratory of Endocrinology, National Health and Family Planning Commission of People’s Republic of China, Beijing 100730, China)

ObjectiveTo detectSRYmutation in 46,XY disorder of sex development (46,XY DSD), analyzeSRYmutation frequency, and to define the clinical features of the patients with the mutation.MethodsA total of sixty-three 46,XY DSD patients admitted to department of endocrinology of Peking Union Medical College Hospital from 2009 to 2014 were enrolled and detailed clinical data were collected. Genomic DNA was extracted from peripheral blood, andSRYwas amplified and sequenced. The mutation was identified by comparing with the online database, and the clinical features were analyzed.ResultsThree novel mutations ofSRYgene were detected in 3 of 63 patients (5%). The 3 patients’ social genders were all female and their karyotypes are 46, XY. Vaginal and uterine structures were present. Sex hormone profiles were consistent with hypergonadotropic hypogonadism. The 3 novel mutations were Pro131His, R76C and L35Afs*25. The former two were mutations in the nuclear localization signal regions of HMG box and highly-conservative amino acids were affected. The latter one was a frameshift mutation resulting in deletion of the entire HMG box. All these were presumably affecting the functional domain of SRY protein severely.ConclusionsThis study identified three novel mutations ofSRYgene causing 46,XY DSD. The detection rate ofSRYmutation was about 5%. It is recommended thatSRYtesting be performed to identify the etiology of the disease.

SRY; gonadal dysgenesis; disorder of sex development

2017- 10- 27

2017- 11- 20

国家自然科学基金(81771576)；国家重点研发项目(2016YFC0905102)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M- 1- 002)

*通信作者(correspondingauthor)：wsheyan@vip.sina.com

1001-6325(2018)01-0026-06

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