miR- 202通过抑制PGC1β表达促进3T3-L1前脂肪细胞分化

伍 迪，凌宏艳，曹 参，何剑琴，杨丝丝，张恺芳，奉水东

(南华大学 1.生理学教研室；2. 附属第二医院 内分泌科；3.社会医学与卫生事业管理学教研室, 湖南 衡阳 421001)

研究论文

miR- 202通过抑制PGC1β表达促进3T3-L1前脂肪细胞分化

伍 迪1#，凌宏艳1#，曹 参2，何剑琴1，杨丝丝1，张恺芳1，奉水东3*

(南华大学 1.生理学教研室；2. 附属第二医院 内分泌科；3.社会医学与卫生事业管理学教研室, 湖南 衡阳 421001)

目的观察miR- 202对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响及可能的机制。方法通过慢病毒感染构建稳定表达AMO-miR- 202和乱序对照miRNA细胞系，随后诱导分化。至分化的第9天，油红O染色观察细胞内脂滴的情况；RT-PCR检测过氧化物酶体激活增殖受体γ2(PPARγ2)和aP2的基因表达；Western blot检测PPARγ2、aP2和miR- 202靶基因PPARγ辅助活化因子1β(PGC1β)蛋白表达。结果经293T细胞慢病毒包装AMO-miR- 202、乱序对照miRNA，荧光显微镜下可见约80%～90%荧光细胞；将上述2组病毒液分别感染3T3-L1前脂肪细胞后，可见约70%～80%荧光细胞。AMO-miR- 202组细胞内脂滴及PPARγ2和aP2的mRNA表达显著低于乱序对照组和对照组(P<0.05)。与乱序对照组和对照组相比，AMO-miR- 202组PGC1β蛋白表达显著增加(P<0.05)，PPARγ2和aP2蛋白表达显著降低(P<0.01)，而乱序对照组和脂肪细胞组上述指标无明显差异。结论miR- 202可能通过抑制PGC1β、提高PPARγ2和aP2的表达促进3T3-L1前脂肪细胞分化。

miR- 202；3T3-L1前脂肪细胞；脂肪细胞分化；PGC1β

肥胖发病率不断增加且呈年轻化趋势，并导致2型糖尿病、高血压和动脉粥样硬化等疾病，严重危害人类健康[1]。在整体水平，能量摄入大于消耗会导致肥胖；在细胞水平，肥胖是因脂肪细胞的数目增多及体积增大所致；深入研究脂肪细胞分化的调控机制有助于预防肥胖的发生。

微小RNA分子(miRNA)是一种内源性的非编码单链小分子RNA，能在转录后水平负性调节基因的表达[2- 3]。研究表明，某些miRNAs参与细胞增殖、分化和凋亡等生理和病理过程[4]，且被证实参与脂肪细胞分化的调节，如，miR- 143通过多效生长因子促进3T3-L1脂肪细胞分化[5]；miR- 17- 92簇通过负性调节肿瘤抑制蛋白Rb2/p130促进3T3-L1细胞分化[6]；miR- 375通过抑制ERK1/2的磷酸化水平来促进3T3-L1脂肪细胞分化[7]；miR- 27a和miR- 27b抑制3T3-L1脂肪细胞分化，但miR- 202是否影响脂肪细胞分化，尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 材料

3T3-L1前脂肪细胞系和293T细胞系(上海中科院细胞库)；大肠杆菌菌株(TaKaRa公司)；DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清(FBS)(Gibco公司)，分化诱导剂1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(1-methyl-3-isobuthylxanthine，IBMX)、油红O染色试剂(Sigma公司)。反义miRNA寡核苷酸-miR- 202(AMO-miR- 202,anti-miRNA oligonucleotide-miR- 202)及乱序对照物、慢病毒包装质粒(Gene copoeia公司)；PCR扩增试剂盒(北京天为时代公司)；羊抗小鼠aP2(apetala2)多克隆抗体、羊抗小鼠氧化物酶体激活增殖受体γ2(peroxisome proliferator-activeted receptor γ2,PPARγ2)多克隆抗体和兔抗小鼠PPARγ辅助活化因子1β(peroxisome proliferator-activeted receptor γ coactivator 1β,PGC1β)多克隆抗体(Santa Cruze公司)；PPARγ2和aP2引物由在线软件primer5设计，上海生工生物工程公司合成，Pubmed验证。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：将3T3-L1和293T细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃和5% CO2培养箱静置培养。当细胞汇合度达80%以上时，可进行1∶2传代或冻存细胞。

1.2.2 慢病毒包装：将293T细胞接种于细胞培养皿，37 ℃、5% CO2培养箱内培养，待细胞汇合达 70%～80%时用于转染。在2个新EP管里加入50 μL基础DMEM培养基(无FBS和P/S),加入10.5 μg DNA，在其中一个EP管里加入50 μL基础DMEM培养基及21 μL脂质体，混匀，室温下孵育5 min。将两个EP管溶液混匀，室温下孵育15 min。在混合液中加入1 mL新鲜DMEM培养基(含FBS和P/S)，混匀，加入293T细胞和3 mL新鲜DMEM培养基，混匀。孵育2 h，加入4 mL新鲜DMEM。孵育10 h弃去培养基，向培养皿里加入10～14 mL新鲜DMEM。孵育48～72 h后，收集培养液于离心管中，1 500 r/min离心20 min。将含AMO-miR- 202和乱序对照质粒的病毒分装500～1 000 μL EP管，保存在-80 ℃。

1.2.3 慢病毒液感染3T3-L1前脂肪细胞：将3T3-L1前脂肪细胞于6孔板中培养至20%～30%汇合度时，在EP管里分别加入含AMO-miR- 202、乱序对照miRNA的病毒液、新鲜DMEM(含FBS、P/S)和Polybrene(病毒液：DMEM=1∶1～4∶1，Polybrene为总体积的1∶2 000)，混匀。移去6孔板中原有DMEM，并加入EP管中混合物，混匀。孵育12 h后，加入1 mL新鲜DMEM。在第24 h，加入1～1.5 mL新鲜DMEM。在36～48 h，将6孔板中原有培养液弃去，换成新鲜DMEM。孵育至72 h，在荧光显微镜下观察绿色荧光的强度进行转染效率的判断。

1.2.4 油红O染色:分别将上述3组诱导分化至第9天的细胞，PBS洗涤3次(每次5 min)，加入60%异丙醇室温下固定15 min，随后加入油红O染色液，染色10 min后蒸馏水冲洗3次，每次1 min。染色后显微镜下观察拍照，分析3T3-L1前脂肪细胞分化率。

1.2.5 RT-PCR检测PPARγ2和aP2的mRNA表达:实验结束时，用Trizol处理细胞，按照说明书提取RNA、反转录合成cDNA，进行PCR扩增。PPARγ2上游引物：5′-CCTTGCTGTGGGGATGTCTC-3′，下游引物:5′-GCCACCTCTTTGCTCTGCTC-3′(319 bp)；aP2上游引物：5′-AACACCGAGATTTCCTTCAA-3′，下游引物:5′-TCACGCCTTTCATAACACAT-3′(193 bp)；β-actin上游引物：5′-TTCTACAATGAGCTGCGTGTG GC-3′，下游引物:5′-CTCATAGCTCTTCTCCAGGG AGGA-3′(457 bp)。PCR反应条件为:95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s(35个循环)；72 ℃ 7 min。反应结束后，各取产物5 μL，1.2%琼脂糖凝胶电泳(60～80 v，60～90 min)，用全自动凝胶分析系统吸光度扫描分析，结果用3个样本的平均相对单位表示。分析各组目的产物及β-actin吸光度值，以二者比值代表目的产物表达量。

1.2.6 miR- 202靶基因预测：通过以下3个生物学预测网站(TargetScan：http://www.TargetScan.org；miRanda：http://www. miRanda.org；miRBase：http://microna.sanger.ac.uk)寻找miR- 202靶基因。

1.2.7 Western blot检测脂肪细胞PGC1β(peroxisome proliferaters activated receptor-γ-coactivator-1)、aP2和PPARγ2蛋白的表达：提取各组细胞蛋白进行蛋白定量后，取蛋白样品30 μg进行电泳, 转膜和封闭、加入抗PPARγ2、aP2和PGC1β抗体孵育，洗涤后加入辣根过氧化酶标记的二抗，孵育，充分洗涤后与ECL化学发光试剂反应，曝光后扫描，用图像分析软件进行吸光度值分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 构建稳定表达AMO-miR- 202和乱序对照miRNA细胞系

2.1.1 慢病毒包装:AMO-miR- 202组和乱序对照组6孔板中的293T细胞，经慢病毒包装过程，在第48～72 h，80%～90%细胞可见荧光，说明慢病毒包装效率高(图1)。

2.1.2 慢病毒液成功感染3T3-L1前脂肪细胞:在第72 h，70%～80%细胞可见荧光，说明病毒感染细胞效率高，成功构建稳定表达AMO-miR- 202、乱序对照miRNA的3T3-L1前脂肪细胞系(图2)。

2.2 miR- 202对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

诱导分化第9天，3组细胞均被油红O染成亮红色，可见较大脂滴，呈典型的脂肪细胞表型，但AMO-miR- 202组红色细胞脂滴明显少于其他2组。

miR- 202对PPARγ2和aP2的mRNA表达影响: 经RT-PCR实验发现：AMO-miR- 202组PPARγ2、aP2的表达显著低于乱序对照组和正常脂肪细胞组(图3)。

A.morphology of the cell from AMO-miR- 202 group with microscope; B.morphology of the cell from AMO-miR- 202 group with fluorescence microscope; C.morphology of the cell from random group with microscope; D.morphology of the cell from random group with fluorescence microscope

图1293T细胞慢病毒包装效率分析
Fig1Analysisof293Tcellslentiviruspackageefficiency(×100)

A.morphology of the cell from AMO-miR- 202 group with microscope; B.morphology of the cell from AMO-miR- 202 group with fluorescence microscope; C.morphology of the cell from random group with microscope; D.morphology of the cell from random group with fluorescence microscope

图2病毒感染3T3-L1前脂肪细胞效率分析
Fig2Analysisoflentivirusinfectedwith3T3-L1preadipocytes(×40)

图3 油红O观察miRNA对脂肪细胞内脂滴的影响Fig 3 miRNA influnce droplets in adipocyte cells by Oil Red O staning(×200)

A.mRNA expression of PPARγ2;B.mRNA expression of aP2;*P<0.05 compared with adipocyte cell group图4 miRNA- 202对3T3-L1脂肪细胞PPARγ2和aP2 mRNA表达的影响Fig 4 miRNA- 202 influence PPARγ2 and aP2 mRNA expression of 3T3-L1 preadipocyte cell(±s,n=3)

2.3 miR- 202靶基因预测

综合多个生物信息学预测网站和软件预测结果，寻找miRNA- 202靶基因，取至少两个软件预测到的基因作为靶基因，结果表明PGC1β可能是其靶基因(图4)。

2.4 miR- 202可促进3T3-L1前脂肪细胞分化

与乱序对照组和正常脂肪细胞组相比，AMO-miR- 202组PGC1β蛋白表达显著增加，PPARγ2和aP2蛋白表达显著下降(图5)。

图5 多种靶基因预测软件预测miR- 202潜在靶基因PGC1βFig 5 Biological prediction site to predict the target gene PGC1β of miR- 202

A.expression of PGC1β detected by Western blot; B.expression of PPARγ2 detected by Western blot; C.expression of aP2 detected by Western blot;*P<0.05,**P<0.01 compared with adipocyte cell group

3 讨论

脂肪细胞分化是决定脂肪细胞体积和数目的关键，目前该方面的研究主要侧重于某些药物，对内源性调控基因研究较少。3T3-L1前脂肪细胞是一种具有脂肪细胞分化潜力的细胞系。本实验选择3T3-L1前脂肪细胞系作为脂肪细胞诱导分化模型，并观察内源性miRNA对脂肪细胞分化调控作用。

在前期研究中，发现3T3-L1前脂肪细胞分化过程中miR- 202表达上调，故本实验设计miR- 202的反义核苷酸抑制其表达，观察miR- 202对脂肪细胞分化的影响。将已转染AMO-miRNA- 202和乱序对照序列的3T3-L1前脂肪细胞诱导分化，油红O染色发现细胞被染成亮红色，呈典型脂肪细胞表型，且AMO-miRNA- 202组经油红O染成亮红色脂滴细胞明显少于其他2组；通过RT-PCR检测PPARγ2和aP2的mRNA表达，发现AMO-miR- 202能显著抑制PPARγ2和aP2的mRNA表达水平，提示miR- 202促进3T3-L1前脂肪细胞分化。

为进一步探讨miR- 202促进3T3-L1前脂肪细胞分化的机制，通过软件预测PGC1β可能是miR- 202的靶基因。PGC1β是新发现的与能量代谢关系最密切的一个转录辅助活化因子，主要表达于棕色脂肪组织、骨骼肌和肝脏，参与脂肪细胞分化、糖脂代谢和能量平衡[8]，研究表明PGC1β参与了3T3-L1细胞系分化过程[9]。AMO-miR- 202可显著增加PGC1β蛋白表达，降低PPARγ2和aP2蛋白表达，提示 miR- 202可能是通过抑制PGC1β表达，提高aP2和PPARγ2蛋白表达来促进3T3-L1脂肪细胞分化。

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miR- 202 promotes the differentiation of 3T3-L1 preadipocyteviainhibiting PGC1β expression

WU Di1#, LING Hong-yan1#, CAO Cen2, HE Jian-qin1, YANG Si-si1, ZHANG Kai-fang1, FENG Shui-dong3*

(1. Dept. of Physiology; 2.Dept. of Endocrinology,the Second Hospital of University of South China;3.Dept. of Social Medicine and Health Service Management,University of South China,Hengyang 421001,China)

ObjectiveTo explore the effect and molecular mechanism of miR- 202 on the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte.MethodsThrough lentivirus infected with 3T3-L1 preadipocytes, we set up the AMO-miR- 202 group and the random control group, then, these cells were induced to differentiate, nine days later, differentiation was assessed by Oil Red O staining and we examined the mRNA expression of PPARγ2 and aP2 by RT-PCR method.We examined the mRNA expression of PPARγ2,aP2 and PGC1β by Western blot method.ResultsAfter packaging lentivirus with AMO-miR- 202 and random sequence control miRNA through cell line 293T, 80%-90% cells with fluorescence were found under fluorescence microscope; After these two lentivirus respectively infected with 3T3-L1 preadipocytes, About 70%-80% cells with fluorescence were found under fluorescence microscope.Oil Red O staining test showed that these cells with Oil Red O stained bright red fat droplets of AMO-miR- 202 group and PPARγ2 and aP2 mRNA expression in the AMO-miR- 202 group significantly lower than control groups (P<0.05).Western blot assay showed that the protein expression of PGC1β in the AMO-miRNA- 202 group was significantly increased(P<0.05), but the expression of aP2 and PPARγ2 was significantly decreased (P<0.01). However, the random control group and the adipocyte group had no significant effect on the above indexes.ConclusionsmiR- 202 can promote the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte by inhibiting the protein expression of PGC1β and improving the protein expression of PPARγ2 and aP2.

miR- 202；3T3-L1 preadipocyte；adipocyte differentiation；PGC1β

2016- 12- 05

2017- 05- 05

教育部留学归国基金[教外司留(2014)1685];湖南教育厅基金(16C1411)；衡阳市科技局基金(2016KJ64)

*通信作者(correspondingauthor)：shuidong_f@hotmail.com

#对本文有相同贡献

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