Sestrin功能的分子机制研究进展

胡 茜，韩 薇

(哈尔滨医科大学附属第一医院 心血管内科， 黑龙江 哈尔滨 150001)

短篇综述

Sestrin功能的分子机制研究进展

胡 茜，韩 薇*

(哈尔滨医科大学附属第一医院 心血管内科， 黑龙江 哈尔滨 150001)

活性氧(ROS)的过度堆积和雷帕霉素作用靶点复合物1(mTORC1)的持续活化是导致相关疾病发生的主要原因。Sestrin是一种抗衰老的多功能蛋白，它作为过氧化物还原酶或者过氧化物酶减少ROS，Sestrin上调自嗜及促进Nrf2活化抑制ROS。Sestrin结合GATOR2，一方面释放GATOR1，抑制RagA/B活性。另一方面启动AMPK，使结节硬化复合物2(TSC2)磷酸化，抑制 Rheb活性。通过抑制RagA/B和Rheb抑制mTORC1。亮氨酸浓度可改变Sestrin构像进而改变其调控mTORC1的功能。

Sestrin；活性氧；雷帕霉素作用靶点复合物1；亮氨酸

适量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)对于维持生理平衡是必需的，然而，ROS的过度聚集导致DNA和蛋白质的损伤,加快相关疾病的进程。雷帕霉素作用靶点复合物1(mechanistic target of rapamycin (mTOR) complex 1，mTORC1)是一个调控疾病进程的重要信号分子，药物抑制mTORC1能够延长寿命，提示mTORC1在疾病进程中有着重要作用。

Sestrin是一种在应激状态下产生的高度保守的蛋白家族。无脊椎动物只有一种Sestrin，脊椎动物有3种Sestrin，即Sestrin1- 3[1]。在结直肠癌细胞中发现，Sertrin1和Sestrin2能够减少ROS水平和抑制mTORC1活性，提示Sestrin可能通过抑制这两种分子来减缓相关疾病的进程。近年来， 测定Sestrin的3D分子结构，揭示了3种功能位点，分别是抑制ROS的活性位点、调控mTOR的活性位点以及亮氨酸的结合位点[2]，本文将从Sestrin的3个功能活性位点介绍Sestrin作用的生化机制。

1 Sestrin抑制氧化应激

在氧化应激损伤下，Sestrin通过几种转录因子包括P53、Nrf2、AP- 1和FoxOs表达上调[1, 3]。过表达的Sestrin2使细胞耐受氧化应激[3]，然而缺乏Sestrin使细胞和组织高度易受氧化应激损害[4- 5]。因此，Sestrin被认为是一种重要的抗氧化防御分子。

1.1 Sestrin作为过氧化物酶的还原酶发挥抗氧化功能

Sestrin和烷基氢化过氧化酶(AhpD)具有相似序列，AphD是一个结核分枝杆菌中的抗氧化蛋白[6]，AphD有两个已知的氧化还原功能：烷基氢过氧化物(一种疏水的ROS)的解毒功能[7]；减少烷基氢化过氧化酶C(AhpC)的半胱氨酸二硫化物的功能[8]。

Sestrin125位点的半胱氨酸发生突变，使Sestrin丧失抗氧化功能[6]，这与AhpD功能性半胱氨酸突变后的表现相似。基于这个功能的相似性，最初认为Sestrin是一种过氧化物酶的还原酶。然而，Sestrin并非像AphD那样能够减少AphC的半胱氨酸二硫化物[8]，而是Sestrin作为半胱氨酸亚磺酸(一种过氧化物酶的过氧化形式)的还原酶[6]。

虽然Sestrin作为过氧化物酶的还原酶能够解释它的抗氧化功能，但是纯化的Sestrin并没有有半胱氨酸亚磺酸还原酶活性，而硫氧还蛋白(sulfiredoxin， Srx)具备这种功能。有人提出Sestrin并不是一个独立的过氧化物酶的还原酶[1, 9]。Sestrin的表达上调促进过氧化的过氧化物酶的还原，减少细胞内的氧化应激损伤可能是通过Sestrin间接上调Srx的表达或者直接减少ROS发挥作用。

1.2 Sestrin调控自嗜抑制ROS

线粒体自嗜对于氧化还原反应内稳态非常关键，因为损伤的线粒体的聚集使ROS过度产生，最终导致退行性病变[10]。Sestrin可以通过活化AMPK和抑制mTORC1上调自嗜。

果蝇研究表明，缺乏Sestrin导致自嗜损害及损伤线粒体的聚集，增加骨骼肌ROS水平[4]。这依赖于AMPK/mTORC1的错误调节和自嗜性清除。以下证据支持：1)药物活化AMPK或者抑制mTORC1恢复了缺乏Sestrin的苍蝇的线粒体稳态；2)Sestrin的突变体(无氧化还原活性的Sestrin)仍然调控AMPK/mTORC1信号通路，并且恢复线粒体稳态[11]；3)AMPK或自嗜相关蛋白1(autophagy related 1，Atg1)、Unc- 51样自嗜启动激酶1(unc- 51-like autophagy-activating kinase 1，ULK1)的表达下调，最终导致缺乏Sestrin所呈现的线粒体表型[4]。而ULK1是一个负责自嗜起始的蛋白激酶，

1.3 Sestrin调控核转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)发挥抗氧化功能

Nrf2是一种转录因子，能够上调一系列抗氧化基因包括PRX、SRX、GST和TRX的表达[12]。在正常环境，胞质接头蛋白(kelch-like ECH-associated protein- 1，Keap1)连接于Nrf2,介导蛋白酶体的降解。应激时，Sestrin连接Keap1、p62[5]和自嗜启动分子ULK1[13]。Sestrin2促进ULK1诱导的p62的磷酸化[13]，进而促进Keap1的降解和Nrf2的活化[14]。这条通路解释了Sestrin是通过上调Nrf2和它的抗氧化靶点来发挥抗氧化功能。仍有2个问题：1)Sestrin、Keap1、p62和ULK1结构之间的相互作用尚不明确；2)Sestrin是否能够连接Keap1，并且以一种氧化还原反应敏感的方式调节Nrf的活性。构建Sestrin的突变体模型(例如过氧化物酶活性的缺失或者调控mTORC1功能的缺失)可能将会为Sestrin在调控Keap1-Nrf2信号通路方面提供重要线索。

1.4 Sestrin作为过氧化物酶发挥抗氧化活性

Sestrin2实际上是一个活化的烷基氢化过氧化物酶[2]，结论基于以下研究结果：1)重组的Sestrin2催化异丙基苯氢过氧化物的还原，异丙基苯氢过氧化物是一种烷烃氢化过氧化物，并且催化效率与AhpD和AhpC相似。2)置换Sesn-A的催化亚基，包括半胱氨酸125位点(Cys125), 酪氨酸127位点(Tyr127), 和组氨酸132位点(His132)，废除了Sestrin2的烷基氢化过氧化酶的活性。

虽然Sestrin2具有过氧化物酶活性，但Sestrin2还原的ROS的底物仍不清楚。氢过氧化物是在细胞中最多并且在生物学上最显著的活性氧形式，但不能被Sestrin2有效地还原[2]。唯一已知Sestrin2的作用底物是异丙基苯氢过氧化物[2]，后者不属于生物细胞中的ROS形式。由于Sestrin2特异地作用于疏水的烷基氢化过氧化物，所以脂性的氢过氧化物可能是Sestrin2的催化底物，而脂质过氧化物参与了年龄与肥胖相关疾病的发展，提示脂质过氧化物可能是Sestrin2的作用底物。如果Sestrin2可逆的氧化性能够影响它在促进调控自嗜和Nrf2方面的功能，那么Sestrin2还有可能作为一个氧化还原反应感应分子。

2 Sestrin调控mTORC1信号通路

两种GTP酶：RagA/B和Rheb，对于mTORC1的活化是必需的。Sestrin结合GATOR2，一个抑制GATOR1活性的异五聚体蛋白复合物，解除了GATOR2对GATOR1的接触抑制，GATOR1是一类鸟苷三磷酸酶启动蛋白(GTPase-activating protein)，游离GATOR1可以抑制RagA/B的活性，从而抑制mTORC1。另外Sestrin-GATOR2复合体可以启动腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)，导致结节硬化复合物2(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)磷酸化，磷酸化TSC2能够抑制Rheb活性，进而抑制mTORC1。从下文讨论Sestrin调控mTORC1通路的相关机制。

2.1 Sestrin调控AMPK抑制mTORC1

Sestrin调控mTORC1依赖于AMPK[11]。Sestrin增加苏氨酸172位点(Thr172)AMPK的磷酸化，使AMPK启动，并进一步促进TSC2的活化。TSC1/2可将Rheb的GTP形式(Rheb-GTP)转变为Rheb的GDP形式(Rheb-GDP)，从而负性调节mTORC1信号通路[11]。Raptor是mTORC1的重要亚基，在能量损耗的情况下AMPK也可以直接磷酸化Raptor，抑制mTORC1的活性。

多种环境中Sestrin均可介导AMPK活化，进而调控mTORC1[15- 16]。果蝇实验表明，Sestrin可以通过AMPK-TSC2信号轴调控年龄相关疾病的进展[4,17]。在Sestrin缺乏的小鼠模型中，药物或者腺病毒活化AMPK同样可以抑制mTORC1活性[15,18]，证明AMPK是Sestrin控制代谢稳态的关键靶点。

近期发现在mTORC1通路中，AMPK可能不是Sestrin的唯一靶点，因为在AMPK敲除(AMPK-null)的小鼠胚胎成纤维细胞中Sestrin同样可以抑制mTORC1[19- 20]。由于Sestrin调控AMPK活化的分子机制尚不清楚。一些研究提出，Sestrin活化AMPK可能是通过Sestrin在AMPK和肝激酶B1(liver kinase B1，LKB1)之间发挥信号支架功能来实现[16]，并且Sestrin上调AMPK亚基表达来获取AMPK的最大活性[21]。因此，尚需更多实验证据来揭示Sestrin调控AMPK的生化机制。

2.2 Sestrin通过减少Rag抑制mTORC1

Rag复合物共有4个亚基，分别是RagA、RagB、RagC和RagD。生理状态下，RagA/B和RagC/D分别与GTP和GDP结合，这是一种Rag二聚体活化的状态。RagA/B·GTP-RagC/D·GDP启动复合体与mTORC1复合体的Raptor相互作用而成为停靠位点，将mTORC1定位于溶酶体膜。Sestrin可以作为GDP解离抑制蛋白(GDP dissociation inhibitor，GDI)减少RagA/B的GTP活化形式来抑制mTORC1。结论基于以下事实：1)在RagB活化的情况下，Sestrin不能抑制mTORC1；2) Sestrin与RagA/B·GTP-RagC/D·GDP激活复合体存在物理作用；3)Sestrin抑制GTP定位于RagA/B蛋白上[20]。

但近期研究反驳了 Sestrin依赖RagA/B抑制mTORC1的设想。人类Sestrin2的晶体结构显示Sestrin和GDI没有结构上的同源性[2]，Sestrin中预计的GDI模体和GDI1在构象上有很大不同，同时Sestrin的假定GDI模体突变并未阻止Sestrin对 mTORC1的抑制[2]。虽然早期免疫组化实验显示人类Sestrin2和Rag复合物在溶酶体膜上重叠[20]，但提高荧光分辨率后发现人类Sestrin2在溶酶体膜之外[19]，说明人类Sestrin2并未在溶酶体膜上控制RagA/B的活性。最后，尚未检测到Sestrin和RagA/B存在直接的物理作用[2,19]。提示Sestrin可能通过未知的信号组件间接地调控RagA/B活性。

2.3 Sestrin通过调控GATOR抑制mTORC1

GATOR复合体包括GATOR1和GATOR2。蛋白组学表明Sestrin和GATOR2(一个调控RagA/B的异五聚体蛋白复合体)存在很强的物理作用[19]，而GATOR2可以通过接触抑制的方式抑制GATOR1。因此，假定Sestrin能够连接GATOR2，从而释放GATOR复合体中的GATOR1，游离的GATOR1抑制RagA/B的活性[19]，进而抑制mTORC1。沉默或敲除GATOR1组件均可消除Sestrin对mTORC1的抑制支持了以上假设[19]。

近期研究发现SesnC(Sestrin的一个结构域)上存在DD模体[2]。后者突变几乎完全阻止了人类Sestrin2和GATOR2的结合[2]，提示DD模体参与构成了一个关键的蛋白结合位点。更重要的是，DD模体的突变阻止了Sestrin活化AMPK[2]。提示DD模体在Sestrin-GATOR2信号通路中的重要性。

生理状态下， RagA/B·GTP-RagC/D·GDP启动复合体与mTORC1复合体的Raptor相互作用将mTORC1定位于溶酶体膜。Rheb-GTP维持mTORC1活性。此时Sestrin和GATOR复合物处于低活性状态，对mTORC1无抑制作用，在应激条件下，Sestrin表达上调并与GATOR2结合，将GATOR1自GATOR复合体中释放，游离的GATOR1抑制RagA/B活性，进而抑制了RagA/B·GTP-RagC/D·GDP启动复合体对mTORC1的膜定位功能，使mTORC1弥散至胞质，从而抑制了mTORC1的活性。

2.4 Sestrin抑制mTORC1的相关生理作用

mTORC1通过整合信号，与生长因子刺激、能量状态、氨基酸和氧的利用率产生联系。mTORC1调控着许多代谢过程，包括蛋白、脂质及细胞器的生物合成，这些过程增加内质网应激，线粒体代谢和ROS的产生。另外，mTORC1通过抑制凋亡和自嗜来抑制分解代谢过程，这些效应通过损伤线粒体的聚集导致超氧化物产生。动物模型显示持续活化的mTORC1可以诱导ROS聚集，导致包括脂肪堆积、胰岛素抵抗、肌衰退、心功能不全、线粒体疾病以及肿瘤发生等病理过程。Sestrin可以抑制mTORC1， 缓解这些病理紊乱[18]。

3 Sestrin活性受亮氨酸调控

亮氨酸可以影响Sestrin对 mTORC1的调控作用：1)亮氨酸可以直接与hSesn2(humanSestrin2)进行物理性结合；2)亮氨酸与hSesn2结合后可以改变hSesn2的熔点并且阻止其与GATOR2结合；3)亮氨酸可以结合于hSesn2晶体的结合袋内，并且亮氨酸的浓度变化可以改变hSesn2的晶体结构[22]；4)野生型hSesn2可以恢复Sestrin敲除(Sestrin-null)的HEK293细胞中亮氨酸对mTORC1通路的调节作用，而亮氨酸结合缺陷的hSesn2突变体却不具备此种功能。根据以上结论，设想当亮氨酸存在时hSesn2不能抑制mTORC1，因为亮氨酸结合hSesn2后改变Sestrin的构象，进而阻止hSesn2与GATOR2之间的相互作用。

近期实验进一步显示了氨基酸对Sestrin的调控作用。首先，真核翻译起始因子2激酶α亚单位(general control nonderepressible 2，GCN2)，能够上调转录因子ATF4，从而诱导hSesn2的表达[23]，提高了氨基酸在mTORC1信号通路中的利用率[23]。其次，在氨基酸缺乏的情况下，Sestrin会被ULK1磷酸化[13]，磷酸化可能会影响Sestrin与亮氨酸结合的能力，从而改变Sestrin的mTORC1调控活性。

4 Sestrin对心血管疾病的调控作用

ROS聚集和许多心血管疾病密切相关。果蝇中失活的dSesn导致骨骼肌和心肌ROS聚集和氧化损伤[4]。在缺血心脏中Sestrin2促进了LKB1介导的AMPK活化[16]。另外一些结果显示在小鼠心脏肥大早期阶段所有Sestrin家族蛋白均表达上调，并在小鼠心脏肥大和心衰晚期阶段显著表达下调[24]。体外实验显示，Sesn1过表达能够减少由DOX引起的心肌细胞凋亡。提示Sestrin蛋白家族在心血管疾病方面具有重要保护作用。抑制mTORC1活性能够显著地减轻压力负荷导致的心肌肥大及减少急性或慢性心肌梗死后的缺血损伤。抑制mTOR能够恢复糖尿病和代谢综合征中的自嗜损害。进一步的实验应致力于研究Sestrin调控mTOR在心血管疾病及代谢疾病中的作用。

5 展望

Sestrin作为一种多功能蛋。对Sestrin结构的研究，显示了该蛋白的3个功能位点，分别调控上述生理功能。进一步研究必须明确Sestrin1- 3在生理功能方面具有哪些异同点及Sestrin如何在不同的环境应激下转换自身的生理功能等。考虑到Sestrin在调节代谢稳态和减缓老年疾病方面所发挥的重要作用，对其进一步研究可望为临床治疗提供新的契机。

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Advances in molecular mechanism of Sestrin function

HU Xi, HAN Wei*

(Dept. of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001,China)

Excessive accumulation of reactive oxygen species (ROS) and Chronic activation of mechanistic target of rapamycin (mTOR) complex 1 (mTORC1) is associated pathologies.Sestrin is a versatile anti-aging protein.Sestrin as a Prx Reductase or as a Peroxidase,which reduce ROS.Sestrin can upregulate autophagy and upregulate Nrf2 and its antioxidant targets,which inhibit ROS. Sestrin bind to GATOR2, releasing GATOR1, and thereby promote the RagA/B-inhibiting activity.On the another hand activating AMPK which promote phosphorylation of TSC2,and thereby inhibit Rheb.Sestrin inhibit mTORC1 through its inhibition of RagA/B and Rheb.Concentration of leucine can change conformation of Sestrin,and thereby change its regulation of mTORC1.

Sestrin；ROS；mTORC1； leucine

2016- 11- 28

2017- 01- 17

国家自然科学基金(81270251)

*通信作者(correspondingauthor)：hanwei2@medmail.com.cn

1001-6325(2018)01-0098-05

R34

A