CYP2A13基因8种错义突变与肺癌易感性的关联研究

刘亭 李朝辉 谢章明 徐迎春 吴敏良 徐笑红 陈枢青

CYP2A13基因8种错义突变与肺癌易感性的关联研究

刘亭 李朝辉 谢章明 徐迎春 吴敏良 徐笑红 陈枢青

目的 探讨细胞色素p450 2A13（Cytochrome p450 2A13，CYP2A13）基因8种错义突变与肺癌易感性的相关性。方法采用以自然人群为基础的病例-对照方法，对2007-2011年间收集的91例肺癌病例以及140例年龄和性别相匹配的正常对照者进行研究。采用等位基因特异扩增法（Allele-Specific Amplification,ASA）对血液样本中CYP2A13基因的8种错义突变位点进行检测。结果在对照组和病例组之间，各错义突变位点的基因型频率均无统计学的差异（均P＞0.05）：p.Arg257Cys（12.1%vs 11%）、p.Thr134_Leu135insThr（2.1%vs 1.1%）、p.Arg101Gln（7.3%vs 4.4%）、p.Phe453Tyr（2.2%vs 1.1%）、p.Arg494Cys（2.9%vs 1.1%）、p.Arg101Ter（6.6%vs 2.2%）、p.Asp158Glu（2.1%vs 1.1%）、p.Val323Leu（0.07%vs 0%）。各错义突变位点的等位基因频率也均无统计学差异（均P＞0.05）：p.Arg257Cys（6.8%vs 5.5%）、p.Thr134_Leu135insThr（1.1%vs 0.5%）、p.Arg101Gln（4.0%vs 2.2%）、p.Phe453Tyr（1.1%vs 0.5%）、p.Arg494Cys（1.5%vs 0.5%）、p.Arg101Ter（4.0%vs 1.1%）、p.Asp158Glu（1.1%vs 0.5%）、p. Val323Leu（0.4%vs 0%）。结论中国汉族人群中存在CYP2A13基因错义突变，但CYP2A13基因错义突变与肺癌易感性可能不存在关联，这提示虽然CYP2A13在肺癌发生中起到了一定作用，但可能不是影响我国汉族人群肺癌易感性的主要因素，还存在其它因素的交互影响。

肺肿瘤/遗传学 多态性 错义突变 CYP2A13

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发生与环境、遗传等诸多因素相关，其中吸烟已经被公认为是最重要的环境危险因素。如同几乎所有的环境性化学毒物，烟草中的致癌物质如NNK、尼古丁首先需要通过代谢活化才能产生致癌作用。细胞色素p450 2A13（cytochrome p450 2A13,CYP2A13）是一种主要在人呼吸道组织中表达的CYP亚型[1]，鼻黏膜，肺和气管中表达量最高[2]。已有研究表明CYP2A13是参与烟草中致癌物质4-（N-甲基-N-亚硝胺-1-（3-吡啶基）-丁酮（NNK）代谢活化的关键酶，而且其代谢效率在迄今所知的人CYP亚型酶中最高[2-3]，此发现在吸烟与肺癌关系研究领域受到密切关注。CYP2A13在人群中广泛存在多态性，其外显子区域已被人类CYP等位基因命名委员会[The Human Cytochrome p450（CYP）Allele Nomenclature Committee]确证具有9个错义突变位点，可引起8种错义变异体，导致CYP2A13的活性产生变化，从而对肺癌易感性产生影响[4-7]。我国肺癌的发病率呈上升趋势，可是到目前为止，尚无研究报道我国人群中CYP2A13基因错义突变与肺癌易感性的关系。考虑到人群遗传背景和接触的环境不同，在我国人群中进行CYP2A13基因多态性与肺癌发生相关性研究仍具有重要意义。因此本研究采用以自然人群为基础的病例-对照方法，对CYP2A13基因错义突变与中国汉族人群肺癌易感性的关系进行了研究，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 采用以人群为基础的病例对照研究。病例组91例肺癌患者，均为2007-09—2011-02浙江省肿瘤医院住院患者。对照组140例健康成年人，其血样收集于2011-01—04浙江大学医学院附属第二医院临床检验科。所有研究对象均为中国浙江省汉族人群，个人之间没有血缘关系。两组在年龄、性别和吸烟史等因素上的分布无统计学差异（均P＞0.05），详见表1。

表1 研究对象基本情况（例）

1.2 血液样本的收集和基因组DNA的提取 抽取研究对象2～3 ml静脉血液，柠檬酸钠抗凝，血液取出后立即-80℃冻存备用。使用AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒提取血液基因组DNA。获得的基因组DNA经过琼脂糖凝胶电泳鉴定完整度、GeneQuant分光光度计测定其浓度和纯度后，贮存于-20℃备用。

1.3 多态性位点的选择 目前被人类CYP等位基因命名委员会收录的CYP2A13基因错义突变位点有9个，其中7个引起氨基酸的改变，1个引起移码突变，还有1个过早引入终止子，共产生8种错义变异体。这9个位点及其导致的氨基酸突变分别是74G＞A，p.Arg25Gln（rs8192784）；3357A＞G，p.Arg257Cys（rs8192789）；1634_1635 insACC，p.Thr134_Leu135insThr（rs57082577）；579G＞A，p.Arg101Gln（rs148044792）；7343T＞A，p.Phe453T -yr（rs72547590）；7465C＞T，p.Arg494Cys（rs138870349）；578C＞T，p.Arg101Ter（rs72552266）；1706C＞G，p.Asp158Glu（rs112337232）；5294G＞T，p.Val323Leu（尚无rs号）（http: //www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2a13.htm）。由于p.Arg25Gln和p.Arg257Cys出现在同一个错义变异体，并且p. Arg25Gln位于CYP2A13蛋白跨膜区，对活性影响不大，所以本文选择了p.Arg257Cys、p.Thr134_Leu135insThr、p.Arg101Gln、p.Phe453Tyr、p.Arg494Cys、p. Arg101Ter、p.Asp158Glu和p.Val323Leu等8个错义突变位点作为研究对象。

1.4 基因多态性检测 采用等位基因特异扩增法（Allele-Specific Amplification,ASA）来进行CYP2A13基因分型。首先以基因组DNA为模板，用高保真性KOD plus DNA聚合酶来扩增含有突变位点的CYP2A13基因片段L1、L2。L1片段的扩增引物为 CTTGCTACACACTCCACCTCCCAGAAACTCCAC（上游引物）和GAGGTGTGTCTGCTAACCAGGACATGAACGG（下游引物）；L2片段的扩增引物为CCCAAGCTCAAACCCTGGTCTCTCTGAGCC（上游引物），CCCTTCCTCTCATCACAGCTCTGAAGGACATC（下游引物）。PCR反应体系50μl，其中10 x buffer 5μl，dNTPs（2mM each）5μl，Mg-SO4（25 mM）3μl，KOD plus 1U，上下游引物（10μM）各2μl，基因组DNA 50 ng；扩增条件为96℃预变性2 min，96℃变性30s，68℃退火加延伸6min，25次循环后，68℃延伸6min。从得到的产物中随机抽取5个样本用于测序，确定所获得的为CYP2A13基因；第二步是进行等位基因特异扩增。按ASA-PCR原理，为每个错义突变位点设计两对引物，见表1。反应体系共25μl，包括稀释50倍的第一步产物 1μl，10 x buffer2.5μl，dNTPs（10 mM each）0.5μl，MgCl2（25mM）1μl，rTaq 0.5μU，上下游引物（10μM）各0.5μl；扩增条件为96℃预变性2min，96℃变性30s，退火30s（退火温度见表2），72℃延伸1 min，循环20次后，72℃延伸5min。在第二步等位基因特异扩增反应中，以第一步反应中测序的5个样品为阳性对照，同时以两个不包含模板的反应管为阴性对照。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件，用直接计数法分析两组中CYP2A13错义突变位点的基因型及等位基因频率，并进行Hardy-Weinberg平衡检验，用χ2检验两组之间的差异。

表2 各错义突变位点的ASA引物

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 由于病例组中未能检测到p.Val323Leu突变，所以无法进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。其它错义突变位点在病例组和对照组的分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（均P＞0.05），这说明样本具有群体代表性。

2.2 两组中错义突变位点的分布 阳性对照的ASA实验结果和测序结果完全一致，阴性对照未检测到扩增条带。对照组中p.Arg101Gln、p.Phe453Tyr、p.Arg494Cys、p. Arg101Ter和p.Val323Leu位点分别有4、3、3、3、2例样本未能成功扩增，两组的基因型和等位基因的分布频率见表3。两组中各突变位点的基因型均以野生纯合型为主，突变大多以杂合型存在，突变纯合型检出极少。两组中各突变位点的基因型和等位基因分布频率差异无统计学意义（均P＞0.05），见表3。CYP2A13基因错义突变与肺癌易感性可能不存在关联。

3 讨论

细胞色素p450是负责代谢外源性化学物质的关键酶，包括对环境致癌物的代谢活化[8-9]，在致癌物组织原位活化及组织特异性致癌效应起着关键作用。CYP2A13是一种主要表达在人的呼吸道组织的CYP亚型酶[2]。2000年，Su等[2]证明了CYP2A13可有效代谢活化烟草特异性致癌物NNK，是迄今所知的NNK代谢效率（Vmax/Km）最高的人CYP亚型酶。此外，Bao等[10-11]发现，致吸烟成瘾的尼古丁和强致癌物质黄曲霉素也可被CYP2A13高效地代谢激活。这些发现提示CYP2A13在肺癌形成中可能起到关键作用。

CYP2A13基因位于人的第19号染色体上，全长基因为7732 bp，由9个外显子组成，编码的CYP2A13蛋白的长度为494个氨基酸，分子量为55 kD[1]。目前已经在CYP2A13外显子区域发现可引起8种错义变异体的9个突变位点，其中p.Arg25Gln和p.Arg257Cys位点出现在同一个错义变异体。由于p.Arg25Gln位点位于CYP2A13蛋白跨膜区，因此对活性影响不大[12]，本文也未对其开展研究。除p.Arg25Gln外，其它8个错义突变位点都能导致CYP2A13酶活性的变化[13]。p.Arg101Ter提前引入了一个终止密码子，使得肽链合成中断，导致蛋白质失去活性[4]。p.Thr134_Leu135insThr和p.Arg101Gln能降低蛋白质稳定性，使得产物活性大幅度降低[12-13]。p. Arg257Cys、p.Phe453Tyr、p.Arg494Cys、p.Asp158Glu和p. Val323Leu等位点虽然不处于蛋白结构的关键位置，但是也能降低20%～70%CYP2A13的NNK代谢效率[13]。鉴于CYP2A13在肺组织中高效表达且能有效代谢激活NNK等致癌物质，可以推断：导致CYP2A13酶活性降低的错义突变可能会降低携带者发生肺癌的风险。目前关于CYP2A13基因多态性与肺癌的关系也有相关研究，但数量较少。虽然Wang等[14]于2003年的研究发现，p.Arg257Cys（导致NNK代谢活性降低50%）能显著降低癌症发病风险，但是CYP2A13基因错义突变与肺癌易感性之间的关联还需要更多的研究来进一步证实。

在本研究中，我们使用ASA方法检测了CYP2A13基因错义突变位点在中国浙江地区汉族人中的分布，探讨了CYP2A13基因错义突变与肺癌易感性的关系。我们发现，在中国汉族人群中存在CYP2A13基因错义突变，其中p.Arg257Cys、p.Arg101Ter和p.Asp158Glu突变的频率分别是6.8%，4.0%和1.1%，和本课题组前期研究一致[15]，也与Cheng（p.Arg257Cys，n=258，5.6%）[16]、Zhang（p.Arg101Ter，n=31，3.2%；p.Asp158Glu，n=28，1.8%）[7]等的研究结果相似。与其它种族相比，p.Thr134_Leu135insThr在日本人中有较高的分布频率（4.9%），p.Arg101Ter在日本人群中分布较低（0.3%）[6]。而 p.Arg101Ter、p. Asp158Glu和p.Val323Leu等错义多态性位点在高斯人群[4]和中国汉族人群中的分布没有统计学差异。p. Thr134_Leu135insThr、p.Arg101Ter能导致CYP2A13酶功能的缺失[12-13]，这两个位点在中国汉族和日本人族群之间的分布差异，很可能会导致两组人群肺癌易感性上的不同。

表3 CYP2A13基因错义突变的分布频率[例（%）]

本研究虽然没有发现CYP2A13基因错义突变的分布在病例组和对照组之间有统计学差异，可以初步认为CYP2A13基因多态性与癌症易感性可能没有关联。但是，从实验结果中可以发现，虽然没有统计学上的差异，但是导致的产物活性缺失的错义多态性位点的分布频率在病例组中有明显的降低，这提示我们虽然NNK的CYP2A13代谢激活途径在肺癌发生中起到了一定作用，但不是影响我国汉族人群肺癌发生的主要因素,可能还存在其它机制导致了个体对NNK等环境毒物易感性的差异，从而产生了个体肺癌易感性上的不同。例如，本课题组发现，NADPH-细胞色素p450氧化还原酶的突变体能增加CYP2A13的活性达10倍之多（数据尚未发表）。虽然CYP2A13错义多态性位点上的突变，均能降低CYP2A13的活性，但如果个体同时存在NADPH-细胞色素p450氧化还原酶突变体，则将减弱CYP2A13突变体带来的影响。这意味着在设计和解释CYP2A13-肺癌易感性流行病学研究时，应该要考虑到多种因素尤其是多种代谢相关基因多态性的影响。鉴于CYP2A13与肺癌易感性之间关系的复杂性，本文的结果尚需要更大样本的流行病学研究予以验证。

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Association between missense mutations of CYP2A13 gene and lung cancer susceptibility

ObjectiveTo investigate the association between missense mutations of CYP2A13 gene and lung cancer susceptibility.MethodsNinety one patients with lung cancer and 140 healthy subjects matched by age and sex were recruited from 2007 to 2011.Genomic DNA was isolated from peripheral blood samples,and a two-step allele-specific amplification (ASA)method was applied to genotyping.ResultsThere were no significant differences in genotype frequency of CYP2A13 missense polymorphism between cases and controls(P＞0.05):p.Arg257Cys(12.1%vs 11%),p.Thr134_Leu135insThr(2.1%vs 1.1%),p.Arg101Gln(7.3%vs 4.4%),p.Phe453Tyr(2.2%vs 1.1%),p.Arg494Cys(2.9%vs 1.1%),p.Arg101Ter(6.6%vs 2.2%), p.Asp158Glu(2.1%vs 1.1%),p.Val323Leu(0.07%vs 0%).No differences existed in the allele frequency between cases and controls(P＞0.05):p.Arg257Cys(6.8%vs 5.5%),p.Thr134_Leu135insThr(1.1%vs 0.5%),p.Arg101Gln(4.0%vs 2.2%),p. Phe453Tyr(1.1%vs 0.5%),p.Arg494Cys(1.5%vs 0.5%),p.Arg101Ter(4.0%vs 1.1%),p.Asp158Glu(1.1%vs 0.5%),p. Val323Leu(0.4%vs 0%).ConclusionThere are CYP2A13 missense polymorphisms in Chinese Han population,but these CYP2A13 missense polymorphisms might not be related to the susceptibility of lung cancer.

Lung neoplasms/Genetic Polymorphism Missense variations CYP2A13

2014-07-30）

（本文编辑：沈昱平）

国家自然科学基金（81273578）；国家科技重大专项基金（重大新药专项课题，2012ZX09506001-004）；贵州省卫生厅科学技术基金项目（丹参与华法林相互作用的机制研究）和贵州省科技厅贵州省科学技术基金项目（黔科合J字[2013]2034号）

550004 贵阳，贵阳医学院药学院贵州省药物制剂重点实验室（刘亭）；浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所（李朝辉、谢章明、徐迎春、陈枢青）；浙江大学医学院附属第二医院（吴敏良）；浙江省肿瘤医院检验科（徐笑红）

陈枢青，E-mail：chenshuqing@zju.edu.cn