大鼠压疮早期的线粒体损伤

周 岩，王 晴，韩 会，何宗泽，汪凤兰，邢凤梅

(华北理工大学 护理与康复学院， 河北 唐山 063000)

研究论文

大鼠压疮早期的线粒体损伤

周 岩，王 晴，韩 会，何宗泽，汪凤兰，邢凤梅*

(华北理工大学 护理与康复学院， 河北 唐山 063000)

目的探讨大鼠压疮早期引起的线粒体损伤情况及其作用。方法将40只大鼠随机分为5组(每组8只)。对照组(control组)大鼠不施压；实验组用特制压力装置对股薄肌处施压(170 mmHg)2 h，放松0.5 h为一个循环(1C)，根据施压循环不同又分为3C、6C、9C和12C组。HE染色法观察受压肌肉组织的病变；Western blot检测Bcl- 2和Bax在受压肌肉组织中的表达；透射电镜观察肌纤维和线粒体等超微结构。结果各实验组随着受压循环的增加出现病理损伤并逐渐加重；与对照组相比各实验组中Bcl- 2的表达均有显著增加(P<0.05)，于3C组达到高峰，随后下降；随着受压循环的增加Bax的表达逐渐增多(P<0.05)，于12C组达到高峰；各实验组随着受压循环的增加肌纤维出现排列紊乱和溶解断裂，线粒体嵴消失及空泡变性等逐渐加重的病理损伤。结论大鼠压疮早期发生了线粒体损伤并诱导了细胞凋亡。

压疮；缺血再灌注损伤；线粒体；凋亡

压疮(pressure ulcer，PU)是卧床患者的常见并发症，发病率居高不下。关于压疮发生机制的探讨，近年来缺血再灌注损伤被认为是压疮深部组织损伤最重要的机制[1]。2007年提出压疮6期分类，在原来4期基础上增加了疑似深部组织损伤压疮和难以分期压疮[2]，并提出缺血再灌注损伤是其病理基础。疑似深部组织损伤压疮肉眼观察与Ⅰ期压疮无明显差异，但具有隐匿性、损伤性和难愈性特点，临床上称为“难免性压疮”[1]，若能对此及时干预将有效防止压疮的发展。目前对于早期压疮尤其是隐匿性压疮的发生机制尚未明确，本实验通过建立大鼠早期压疮模型，检测相关凋亡蛋白及线粒体变化，初步探讨线粒体损伤情况及在大鼠早期压疮中的作用，为有效防治早期压疮提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级成年雄性Wistar大鼠40只，体质量为250～300 g[ 华北理工大学实验动物中心，许可证号：SYXK(冀)2010- 0038 ]。将大鼠随机分为5组，每组8只，即：对照组(control)和实验组，实验组又分为3C、6C、9C和12C组。

1.1.2 试剂：兔源Bcl- 2多克隆抗体、鼠源Bax单克隆抗体和鼠源β-Tubulin单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备：参照文献[3]报道应用特制压力装置对大鼠施压(170 mmHg)2 h，放松0.5 h为一个循环(1C)，分别施压0、3、6、9和12个循环。造模过程中麻药按需补充，每2.5 h腹腔注射给予5%葡萄糖和0.9%氯化钠溶液1～2 mL/次。

1.2.2 标本采集：在实验终点，冰上采集受压肌肉组织标本，4 ℃ 0.9%氯化钠溶液冲洗，滤纸吸干水分，放于-80 ℃超低温冰箱中备用；采集0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm体积的受压组织标本，10 %多聚甲醛固定备用。

1.2.3 HE染色法：将固定好的受压肌肉组织标本制成石蜡切片，应用光学显微镜观察组织的病理学变化，采集图片。

1.2.4 Western blot检测：将受压肌肉组织剪碎，加入PBS匀浆，离心后弃上清，加入裂解液和蛋白酶抑制剂(PMSF)充分混匀，于冰上裂解30 min，15 000 r/min离心15 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度，蛋白分装和变性，制备SDS-PAGE进行电泳。转膜并用脱脂牛奶封闭2 h，孵育Bcl- 2、Bax和β-Tubulin一抗，4 ℃过夜。TBST冲洗，室温孵育二抗2 h。TBST冲洗，ECL显影，应用Image J 软件分析Bcl- 2和Bax的表达量，并观察Bcl- 2/Bax比值在各组间的变化。

1.2.5 透射电镜分析：将制作好的受压肌肉组织切片使用透射电镜观察肌纤维和线粒体等超微结构的病理变化并采集图片。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 光镜观察各组大鼠受压肌肉组织的病理学改变

对照组肌纤维排列紧密，形态正常，无病理改变；3C组肌纤维结构较完整，排列较整齐；6C组肌纤维出现断裂、溶解和排列紊乱等现象；9C组横纹肌消失，肌纤维断裂溶解严重，有少量炎性细胞浸润，出现空泡样变性；12C组肌纤维严重破坏，肌间隙明显增宽，间质区域出现大量炎性细胞浸润，并有玻璃样变性等病理改变(图1)。

2.2 Western blot检测各组大鼠受压肌肉组织中Bcl- 2、Bax表达水平化

1)与对照组相比，各实验组Bcl- 2的表达均显著升高(P<0.05)，于3C时达高峰(图2，表1)。Bax在对照组有少量表达，随着受压循环的增加各实验组Bax的表达与对照组相比逐渐增多(P<0.05)，于12C时达高峰(图2，表1)。

2)与对照组相比，6C、9C和12C组Bcl- 2/Bax比值显著降低，呈逐渐下降的趋势(P<0.05)(表1)。

图1 各组大鼠受压肌肉组织的病理学改变Fig 1 Histopathological change of compressed muscle tissues in each group

图2 各组大鼠受压肌肉组织中Bax和Bcl- 2表达水平Fig 2 Expression of Bcl- 2, Bax protein in compressed muscle tissue of each group

groupBcl-2BaxBcl-2/Baxcontrol 0.57±0.03 0.32±0.02 1.79±0.153C 1.70±0.04* 0.92±0.05* 1.81±0.106C 1.30±0.09*# 1.49±0.06* 0.87±0.03*#9C 1.24±0.08*# 2.22±0.20 0.57±0.0912C 1.20±0.10*# 2.99±0.30* 0.40±0.03*△

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with 3C group;△P<0.05 compared with 9C group.

2.3 透射电镜观察各组大鼠受压肌肉组织超微结构的变化

对照组中肌纤维排列整齐紧密，线粒体形态完整，内部的嵴及基质整齐；3C组肌纤维形态基本正常；6C组肌纤维排列紊乱，开始出现断裂和溶解，线粒体大小不等，嵴及基质减少，有明显扩张，可见空泡样变性；9C组肌纤维溶解和断裂严重，有明显的水肿和空泡变性，部分线粒体出现溶解破裂，并有新生不成熟线粒体出现；12C组中出现大量肌纤维碎片，线粒体溶解进一步增多(图3)。

3 讨论

与皮肤组织相比，肌肉组织血管较丰富，对缺血和缺氧更为敏感，国外研究[4]指出皮肤和肌肉同时受压后，肌肉组织更容易受到损伤，并认为肌细胞损伤是压疮发展的重要标志。光镜观察显示，各实验组大鼠肌肉组织损伤情况随着受压循环的增加逐渐加重、出现肌纤维排列紊乱、断裂、溶解和变性等病理改变，间质区域出现大量炎性细胞浸润，说明不完全缺血再灌注使受压肌纤维遭到破坏，诱发了炎性反应等病理反应，造成了受压肌肉组织的损伤。

线粒体通路是细胞凋亡的内在途经，Bcl- 2家族蛋白是凋亡调控的关键因素[5]，其中Bax具有促凋亡的作用，而Bcl- 2是典型的抑凋亡因子。Bcl- 2/Bax比值决定了细胞生存与否，也是反映线粒体功能的指标之一[6]。Bcl- 2/Bax比值增加，细胞趋于存活，疾病预后良好；比值减少，细胞趋于凋亡，疾病预后较差。结果显示：Bax在对照组中有少量表达，在实验组中随着受压循环的增加表达逐渐增多； Bcl- 2在对照组中有少量表达，于3C组时达高峰，后随着受压循环的增加逐渐减少；与对照组相比3C组Bcl- 2/Bax比值有所增加但不明显，6C组、9C组和12C组中Bcl- 2/Bax比值呈逐渐降低的趋势。说明正常状态下Bax 和Bcl- 2在细胞内保持一定的动态平衡来维持基本的代谢更新，在压疮初期受压组织通过上调Bcl- 2的表达来抑制细胞凋亡，但随着缺血再灌注损伤的逐渐加重，Bax表达增多，Bcl- 2表达受到抑制，导致线粒体膜通透性增加，引发细胞凋亡，肌纤维损伤加重，与光镜观察结果一致。故压疮早期应充分重视并及时干预可以阻止压疮的继续发展，否则大量细胞凋亡会使压疮进一步恶化难以控制。

图3 各组大鼠受压肌肉组织超微结构的变化Fig 3 Ultrastructural change of the compressed muscle tissue in each group

线粒体对缺血缺氧的变化尤其敏感[7]，受压导致的不完全缺血缺氧会直接导致其结构发生变化，失去正常生理功能，甚至释放凋亡启动因子，引发细胞凋亡。观察显示，压疮初期线粒体体积增大，内部嵴和基质开始发生损伤，随着受压循环的增加，受压肌肉组织中线粒体损伤明显，甚至溶解破裂。这说明大鼠压疮早期线粒体受到严重损伤，并可能诱发了受压肌细胞的凋亡。结合Western blot结果，各实验组中Bax表达的逐渐升高、Bcl- 2/Bax比值的逐渐降低均会导致线粒体膜通道的开放，结构受损，释放凋亡启动因子，诱发凋亡，最终加重受压肌肉组织的损伤。

综上所述，在大鼠压疮早期随着局部组织受压循环的增加，促凋亡因子表达逐渐增多，线粒体出现损伤并逐渐加重，受损的线粒体释放凋亡启动因子，诱发了肌细胞的凋亡，这可能促进了早期压疮及难免性压疮的发生及其恶化。

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Mitochondrial damage in early stage of pressure ulcer in rats

ZHOU Yan, WANG Qing, HAN Hui, HE Zong-ze, WANG Feng-lan, XING Feng-mei*

(College of Nursing and Rehabilitation, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo investigate the mitochondrial damage and its effect in early stage of pressure ulcer in rats.MethodsForty rats were randomly divided into 5 groups(n=8), control group(Con group) rats without stress, the experimental group was treated with of 170 mmHg for 2 h and relax 0.5 h as one cycle(1C), experimental group was divided into 3C, 6C, 9C and 12C group. The pathological changes of the compressed muscle tissue of the rats in each group were observed by HE staining, Western blot was used to detect the expression of Bcl- 2 and Bax in the compressed tissue, and the ultrastructure of muscle fibers and mitochondria were observed by transmission electron microscope.ResultsThere were pathological damage and gradually increased in the experimental groups, with the increase of compression cycle; the expression of Bcl- 2 in each experimental group was significantly increased as compared with the control group(P<0.05), in the 3C group reached the peak, and then decreased; the expression of Bax was increased gradually with the increase of compression cycle(P<0.05), and in the 12C group reached the peak; with the increase of the compression cycle the muscle fibers of each experimental group appeared gradually increased pathological damage: disorder, dissolution and fracture, the ridge of the mitochondria disappeared, vacuolar degeneration,etal.ConclusionsIn the early stage of pres-sure ulcer in a rat, it brings occurred mitochondrial damage and induces apoptosis.

pressure ulcer; ischemia/reperfusion injury; mitochondria; apoptosis

2016- 11- 24

2017- 03- 24

省科技厅基金项目(16277787D)；华北理工大学研究生创新项目(2016S29)

*通信作者(correspondingauthor)：shanxing06@aliyun.com

1001-6325(2018)01-0042-05

R632.1

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