结直肠癌KRAS突变与临床病理特征的关系

晋 龙，眭玉霞，王丽萍，陈灵锋，陈小岩

(福建医科大学省立临床医学院 福建省立医院 1.病理科； 2.药学部， 福建 福州 350001)

研究论文

结直肠癌KRAS突变与临床病理特征的关系

晋 龙1，眭玉霞2*，王丽萍1，陈灵锋1，陈小岩1

(福建医科大学省立临床医学院 福建省立医院 1.病理科； 2.药学部， 福建 福州 350001)

目的检测结直肠患者KRAS的突变情况，分析KRAS突变与临床病理特征的关系。方法应用蝎形探针扩增阻滞突变系统(ARMS)荧光定量PCR技术，检测结直肠癌患者KRAS第12和13位密码子的突变情况并分析其与临床病理特征的关系。结果1 207例结直肠癌KRAS突变率为42.92%(518/1 207)。第12号密码子6种突变类型，其中G12D突变率16.32%(197/1 207)；G12V突变率10.36%(125/1 207)；G12C突变率3.31%(40/1 207)；G12S突变率2.40%(29/1 207)；G12A突变率1.74%(21/1 207)；G12R突变率0.58%(7/1 207)。第13号密码子G13D突变率为9.69%(117/1 207)。还检测出8种同时存在两种突变类型及一种同时存在3种突变类型。女性患者KRAS突变率(46.21%)高于男性(40.46%，P<0.05)。KRAS在右半结肠突变率(46.45%)和直肠突变率(44.50%)均高于左半结肠(37.50%，P<0.05)。结论结直肠癌KRAS突变有多种类型，并且多种突变类型可同时存在。女性患者突变率高于男性患者，右半结肠和直肠突变率均高于左半结肠。

结直肠肿瘤；DNA突变分析；基因；ras；聚合酶链反应

最新癌症统计结果显示，结直肠癌(colorectal cancer，CRC) 发病率居全球常见恶性肿瘤的第3位，病死率居第4位[1]。随着CRC病死率逐年增高，临床标准的手术及放、化疗方案已满足不了现状[2]，伴随着精准医疗理念的准入，CRC的治疗也迎来个体化靶向治疗时代。分子靶向药物西妥昔单抗应用于结直肠癌治疗是近年来结直肠癌药物治疗的重大进展之一[3]。

药物临床研究结果表明，KRAS的2号外显子第12、13位密码子的突变状态与阻断EGFR的单克隆抗体——西妥昔单抗、帕尼单抗的疗效明确相关，KRAS野生型的患者可以从西妥昔单抗和帕尼单抗的治疗中获得最大化的生存效益，而KRAS突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用[4- 5]。

早在2008年确定KRAS状态为是否对结直肠癌患者使用西妥昔单抗的标准之一。同时中国卫生部颁布的《结直肠癌诊疗规范(2010年版)》中也推荐西妥昔单抗用于治疗KRAS野生型患者。2011年美国《国家综合癌症网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》已明确提出KRAS状态检测为是否对结直肠癌患者使用西妥昔单抗或帕尼单抗的标准，接受EGFR单抗治疗前需进行KRAS检测。

应用蝎形探针扩增阻滞突变系统(scorpions amplification refractory mutation system, scorpions ARMS)荧光定量PCR方法，对1 207例结直肠癌肿瘤组织标本进行KRAS2号外显子第12、13位密码子的7个突变位点进行检测，分析其与临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料：收集福建省立医院病理科2013年9月至2016年7月确诊的1 207例行手术切除的结直肠癌组织标本。其中男性692例，女性515例，年龄24～83岁，平均62.46岁。所有材料均为10%中性甲醛固定、石蜡包埋的组织。该研究经本单位伦理委员会批准并取得所有涉及该项研究患者的同意。

1.1.2 试剂： DNA/RNA共分离试剂盒及KRAS突变基因检测试剂(厦门艾德生物医药科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 组织DNA的提取：切取3张5 μm厚的石蜡包埋组织样本，置于1.5 mL EP管内，二甲苯脱蜡后用DNA分离试剂盒提取基因组DNA。使用Nanodrop 2000测定DNA的浓度，DNA的A260/A280介于1.8～2.1。

1.2.2 蝎形探针扩增阻滞突变系统(scorpions amplification refractory mutation system, scorpions ARMS)荧光定量PCR检测石蜡包埋组织KRAS的2号外显子12、13位密码子的7个突变位点：根据试剂盒说明操作：PCR反应条件为：第1阶段：42 ℃ 5 min，95 ℃ 5 min，1个循环；第2阶段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s,10个循环；第3阶段：93 ℃ 20 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，共30个循环；信号收集：第3阶段60 ℃时收集FAM和HEX信号，进行实时定量PCR。

1.3 统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计分析，各组间KRAS突变与CRC临床病理特征参数关系用χ2检验及Fisher精确概率法进行检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KRAS在结直肠癌中突变检测结果

1 207例结直肠癌标本中检测到518例KRAS突变，突变检出率为 42.92%(518/1207)。第12号密码子检出6种突变类型和第13号密码子检出1种突变。并且还检测出8种同时存在两种突变类型(双突变)及一种同时存在3种突变类型(3突变)，五例G12D和G12C双突变，三例G12D和G13D双突变，三例G12D和G12V双突变，二例G12D和G12A双突变，二例G12A和G12C双突变，G12D和G12S双突变、G12A和G12V双突变及G12V和G12C双突变各一例。3突变类型为G12D、G13D及G12A同时突变1例(图1，表1)。

A.G12D mutation; B.G12V mutation; C.G12C mutation; D.G12S mutation; E.G12A mutation; F.G12R mutation; G.G13D mutation

图1 KRAS突变Fig 1 KRAS mutations

2.2 KRAS突变与结直肠癌临床病理特征的关系

本组研究中女性结直肠癌患者KRAS突变检出率为46.21%(238/515)，明显高于男性患者40.46%(280/692)(P<0.05)。并且检测还发现，KRAS在右半结肠癌突变率(46.45%，131/282)和直肠癌突变率(44.50%，255/573)高于左半结肠(37.50%，132/352)(P<0.05)。而与患者年龄、肿瘤大小、临床分期、分化程度和有无淋巴结转移无相关性。KRAS突变在术前血清癌胚抗原(CEA)升高组的突变检出率50.00%(247/494)高于术前血清癌胚抗原(CEA)正常组34.56%(179/518)(P<0.05)。并且KRAS突变在术前血清CA199升高组的突变检出率57.53%(168/292)高于术前血清CA199正常组35.44%(252/711)(P<0.05)(表2)。

3 讨论

应用将蝎形探针(scorpion)及扩增阻滞突变系统结合起来的scorpion ARMS法荧光定量PCR技术检测1 207例结直肠癌患者KRAS2号外显子第12和13位密码子的突变变情况。该方法最大的优点是敏感性高达1.0%，可检测出样品中含量低至1.0%的突变基因，可以最大限度地缩短目标产物的长度，解决因石蜡包埋组织标本提取的DNA大部分片段化而无法得到准确检测结果的难题。

表2 KRAS突变与结直肠癌临床病理特征的关系

*P<0.05 compared with left colon；**P<0.05 compared with left colon.

研究发现结直肠癌突变检出率为42.92%。与文献报道的结直肠癌KRAS突变检出率30%～45%相符[4- 7]，ARMS荧光定量PCR技术可以快速准确地检测出结直肠癌石蜡组织KRAS的突变状态。KRAS突变检出率与国内研究相比稍偏高[8]，这有可能与福建省为胃肠道恶性肿瘤高发地区有关。

国内外均报道少见KRAS2号外显子第12和13位密码子同时突变，而本次研究发现8种同时存在2种突变类型(双突变)及一种同时存在3种突变类型(3突变)，包括五例G12D和G12C双突变，三例G12D和G13D双突变，三例G12D和G12V双突变，二例G12D和G12A双突变，二例G12A和G12C双突变，G12D和G12S双突变、G12A和G12V双突变及G12V和G12C双突变各一例。3突变类型为G12D、G13D及G12同时突变一例。虽然G12D和G12S及G12A和G12V双突变类型国内学者有报道[10]，但是其余双突变类型国内鲜有报道。国外学者也有报道在结直肠癌病例中同时检测到第12和13位密码子双突变或者3突变，如G12D与G13D双突变，G12S、G12A与G13S3突变等[9- 10]。说明在结直肠癌肿瘤组织中KRAS突变类型有多种形式，并见可以存在多种突变类型同时存在。

研究结果显示，女性患者KRAS突变率高于男性，这与国内学者的研究结果相符[11],这可能提示KRAS突变直接或间接与性激素相关。而KRAS突变与患者年龄、肿瘤大小、分化程度、组织学类型无相关性。

并且还发现KRAS在右半结肠癌突变率和直肠癌突变率高于左半结肠。有学者报道，KRAS突变与结直肠癌发生部位具有明显关系，认为KRAS突变在近端结肠更常见，其中KRAS以第13位密码子突变在近端结肠更常见[9],但也有报道KRAS第12密码子突变更常见于近端结肠癌[12]，这也与研究结果KRAS突变更常见于右半结肠相符。而且检测KRAS以G12D位点突变最多见，由于此位点靠近基因的功能区，是导致KRAS功能丧失的主要原因，提示KRAS功能的丧失在右半结肠癌和直肠癌要比左半结肠癌更为普遍。

目前CRC可通过手术切除、化疗、放疗和靶向治疗等多种方式进行治疗，靶向结直肠癌治疗的EGFR单抗药物出现对治疗CRC具有里程碑的意义，结直肠癌患者组织中KRAS存在较高的突变率，通过检测KRAS突变状态可以有针对性地筛选出对抗EGFR单抗药物治疗有效的结直肠癌患者，能够更有效地指导精准医学个体化治疗。

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Correlation ofKRASmutations and clinicopathological parameters in colorectal carcinoma

JIN Long1, SUI Yu-xia2*, WANG Li-ping1, CHEN Ling-feng1, CHEN Xiao-yan1

(1.Dept. of Pathology; 2.Dept. of Pharmacy, Fujian Provincial Hospital, Fujian Provincial Clinical Medical College,Fujian Medical University, Fuzhou 350001，China)

ObjectiveTo investigate mutation rate and types ofKRASin colorectal carcinoma, and to analyze the relationship betweenKRASmutation and clinicopathological parameters in patients with colorectal carcinoma(CRC).MethodsScorpions Amplification Refractory Mutation System(ARMS) fluorescence quantitative PCR was performed to detect the mutations in codons 12 and 13 ofKRASand to correlate between clinicopathological characteristics and the presence of variousKRASmutations of colorectal carcinoma.ResultsKRASmutations were identified in 518 patients(42.92%)，including G12D(197 cases, 16.32%)，G12V(125 cases, 10.36%)，G12C(40 cases, 3.31%)，G12S(29 cases, 2.40%)，G12A(21cases, 1.74%)，G12R(7 cases, 0.58%)，13D(117 cases, 9.69%). Female patients had a higherKRASmutation rate than male (46.21%, 238/515 vs.40.46%, 280/692,P<0.05).KRASmutation was significantly higher in right colon cancer(46.45%，131/282)and in rectal cancer(44.50%，255/573)than that in left colon cancer(37.50%，132/352)(P<0.05，P<0.05).ConclusionsThere are many types ofKRASmutations in colorectal cancer, and many mutation types exist simultaneously.The detection rate ofKRASmutation is higher in female CRC patients than in the males. The detection rate ofKRASmutation is significantly higher in right colon cancer and in rectal cancer than that in left colon cancer.

colorectal neoplasms; DNA mutational analysis; genes; ras; polymerase chain reaction

2016- 12- 12

2017- 03- 23

福建省自然科学基金(2015J01424)；福建省立医院院内优秀青年基金(2014074)

*通信作者(correspondingauthor)：suiyuxiapharmacy@163.com

1001-6325(2018)01-0032-05

R735.35

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