广西壮族自治区壮族人群白细胞介素23受体基因单核苷酸多态性分析

吴昭元，谢克恭，陆潞，卢贤哲，黄可，廖林波，唐毓金

(1右江民族医学院研究生学院，广西百色 533000；2右江民族医学院附属医院)

广西壮族自治区壮族人群白细胞介素23受体基因单核苷酸多态性分析

吴昭元1，谢克恭2，陆潞2，卢贤哲2，黄可2，廖林波1，唐毓金2

(1右江民族医学院研究生学院，广西百色 533000；2右江民族医学院附属医院)

目的分析广西壮族自治区壮族人群白细胞介素23受体(IL-23R)基因rs10889677、rs7530511位点单核苷酸多态性(SNP)。方法采用SNaP shot SNP分型技术检测150例广西壮族人群IL-23R基因rs10889677、rs7530511位点SNP，并根据国际人类基因组计划公布的中国北京、日本、墨西哥、印第安人群的SNP分型数据，比较上述5个人群两位点的基因型、等位基因频率。结果不同性别广西壮族人群IL-23R基因rs10889677位点基因型及等位基因频率比较无差异(P均>0.05)。广西壮族人群与日本、墨西哥、印第安人群比较，IL-23R基因rs10889677位点AA、AC、CC基因型频率和A、C等位基因频率有差异(P均<0.05)；与北京人群比较，等位基因频率有差异(P均<0.05)。广西壮族人群与北京、墨西哥、印第安人群比较，IL-23R基因rs7530511位点CC、CT、TT基因型频率和C、T等位基因频率比较有差异(P均<0.05)；与日本人群比较，基因型频率有差异(P均<0.05)。结论广西壮族人群IL-23R基因rs10889677、rs7530511位点存在多态性且与其他种族人群相比存在差异性。

白细胞介素23受体基因；白细胞介素23受体基因rs10889677位点；白细胞介素23受体基因rs7530511位点；单核苷酸多态性

白细胞介素23(IL-23)是一种由p19亚基和p40亚基通过二硫键连接后产生的异源二聚体细胞因子，IL-23的受体复合物有IL-12Rβ1和IL-23R，其中IL-23R在介导的细胞内信号传导起主要作用，人IL-23R基因定位在人类1号染色体150 kb的位置上[1,2]。研究[3～5]发现，IL-23R基因多个位点存在多态性，这些多态性可能影响基因的转录和表达，并且与炎症性肠病、酒精性股骨头坏死、类风湿性关节炎、牛皮癣、肿瘤等疾病的易感性有关。通过探究基因组核酸序列的遗传变异、环境因素与某些疾病的关联性来寻找疾病相关基因，不仅能对疾病的发病机制可更进一步了解，同时为今后对某些疾病的易感性评估、早期诊断及药物基因治疗提供研究基础。本文采用单核苷酸多态性(SNP)分型技术检测150例广西壮族人群IL-23R基因rs10889677、rs7530511位点的SNP，并通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)检索Hap Map数据库公布的中国北京、日本、墨西哥、印第安人群相应的位点进行比较分析，旨在为某些高发疾病进行早期诊断及预防的相关研究提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 随机选取2015年8月～2016年8月到广西右江民族医学院附属医院进行健康体检的健康体检者150例，男65例，女85例；年龄22～59(32.33±11.19)岁；所有研究对象籍贯均为广西壮族自治区，民族为壮族，且无遗传疾病史，排除高血压、糖尿病等基础疾病，各项实验室检查指标基本正常，所有研究对象均知情同意。

1.2 IL-23R基因SNP分析方法 ①抽取受试者清晨、空腹外周静脉血2 mL，置于枸橼酸钠抗凝管中，采用DNA提取试剂盒从血标本中提取基因组DNA，置于-80 ℃冰箱保存备用。②根据NCBI上查找的IL-23R易感基因，选择包含IL-23R rs10889677、rs7530511位点的序列，利用在线软件Primer3进行引物设计。③取1 μL 1%agarose电泳对DNA样本进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度(5～10 ng/μL)。④取20 μL 1×GC-I buffer(Takara.)、3.0 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTP、1 U HotStarTaq polymerase(Qiagen Inc.)及1 μL样本DNA和1 μL多重PCR引物进行多重PCR反应，具体反应条件如下：95 ℃、2 min；94 ℃、20 s，65 ℃、40 s，72 ℃、1.5 min，共11个循环；94 ℃、20 s，59 ℃、30 s，72 ℃、1.5 min，共24个循环；72 ℃、2 min，4 ℃保存。⑤在10 μL PCR产物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶，37 ℃温浴1 h，然后75 ℃灭活15 min进行PCR产物纯化。⑥取5 μL SNaP shot Multiplex Kit(ABI)、2 μL纯化后多重PCR产物、1 μL延伸引物混合物、2 μL超纯水进行SNaP shot多重单碱基延伸反应。具体反应条件如下：96 ℃、1 min；96 ℃、10 s，55 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共28个循环；4 ℃保存。⑦在10 μL延伸产物中加入1 U SAP酶，37 ℃温浴1 h，然后75 ℃灭活15 min进行延伸产物纯化。⑧取0.5 μL纯化后的延伸产物与0.5 μL Liz120 SIZE STANDARD、9 μL Hi-Di混匀，95 ℃变性5 min后使用ABI3730XL测序仪进行测序，测序仪上收集的数据再使用软件GeneMapper4.1进行相应位点SNP分型的分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。用Hardy-Weinberg遗传平衡检验方法进行基因型分布遗传平衡吻合度检验，通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)检索Hap Map数据库公布的北京、日本、墨西哥、印第安人群相应的位点进行比较分析，2位点的基因型和等位基因频率采用χ2检验进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-23R基因两位点测序结果 rs10889677位点的基因型有3种，分别是CC、CT、TT；rs7530511位点的基因型有3种，分别是CC、CA、AA。

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果 纳入人群符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05)，表明本实验所选取人群的基因频率可以代表广西壮族人群的基因频率。

2.3 不同性别广西壮族人群IL-23R基因rs10889677位点基因型及等位基因频率比较 结果见表1。由表1可知，不同性别广西壮族人群IL-23R基因rs10889677位点基因型及等位基因频率无差异(P均>0.05)。

表1 不同性别广西壮族人群IL-23R基因rs10889677位点基因型及等位基因频率比较

2.4 不同性别广西壮族人群IL-23R基因rs7530511位点基因型及等位基因频率比较 结果见表2。由表2可知，不同性别广西壮族人群IL-23R基因rs7530511位点基因型及等位基因频率无差异(P均>0.05)。

表2 不同性别广西壮族人群IL-23R基因rs7530511位点基因型及等位基因频率比较

2.5 广西壮族人群IL-23R基因rs10889677位点基因型及等位基因频率与其他种族人群比较 结果见表3。由表3可知，广西壮族人群与日本、墨西哥、印第安人群比较，IL-23R基因rs10889677位点AA、AC、CC基因型频率和A、C等位基因频率有差异(P均<0.05)；与北京人群比较，基因型频率无差异(P均>0.05)，等位基因频率有差异(P均<0.05)。

表3 广西壮族人群IL-23R基因rs10889677位点基因型及等位基因频率与其他种族人群比较

2.6 广西壮族人群IL-23R基因rs7530511位点基因型及等位基因频率与其他种族人群比较 结果见表4。由表4可知，广西壮族人群与北京、墨西哥、印第安人群比较，IL-23R基因rs7530511位点CC、CT、TT基因型频率和C、T等位基因频率比较有差异(P均<0.05)；与日本人群比较，基因型频率有差异(P均<0.05)，等位基因频率无差异(P均>0.05)。

表4 广西壮族人群IL-23R基因rs7530511位点基因型及等位基因频率与其他种族人群比较

3 讨论

IL-23的受体复合物是由IL-23R和IL-12Rβ1两个亚基共同组成的。IL-23R基因定位在人类1号染色体1p31.3上，是由胞外配体结合区、跨膜区、胞内区三部分组成的Ⅰ型跨膜蛋白[6]。人的T淋巴细胞、树突细胞和巨噬细胞的胞膜上均可表达IL-23R[7]。IL-23可与这些细胞表达的IL-23R特异性结合，通过IL-23R介导细胞内的信号转导实现其功能，通过Jak/Stat反应途径激活Jau激酶、酪氨酸蛋白激酶，磷酸化受体胞内区Stat3为主的Stat结合位点，Stat分子以二聚体方式聚集及再次被磷酸化后入核，作用于下游的靶基因[8]。IL-23与IL-23R结合后，能促进T细胞增殖及分化，诱导T细胞产生IFN-γ，诱导TH17分泌IL-17相关的IL-17A、IL-17F、IL-22、GM-CSF等细胞因子，参与多种疾病如炎症反应、自身免疫性疾病等的过程[9]。

随着遗传学的发展，遗传因素在疾病发生中的作用逐渐成为研究的重点，特别是多基因及环境因素共同作用的复杂疾病更是得到人们的重视。遗传和环境因素可以使人基因组中出现SNP从而引起DNA序列的多态性，某些SNPs会直接改变基因蛋白顺序，与某些性状和疾病有直接的关系[10]。IL-23R基因序列在其外显子、启动子、内含子或基因间区域均存在许多SNP位点。目前，国内外关于IL-23R基因rs10889677、rs7530511位点多态性与疾病易感性的研究较多。Tang等[11]为了探讨IL-23R基因的多态性与膀胱移行细胞癌相关性，对226例膀胱癌患者rs10889677位点的基因型和等位基因频率进行检测，发现与对照组相比，膀胱癌患者等位基因C的频率显著增加，提示IL-23R基因多态性可能在中国人群膀胱癌易感性中起重要作用。另外Liu等对IL-23R的3种常见位点(rs6682925、rs10889677、rs1884444)多态性与癌症风险之间的关系进行Meta分析，IL-23R基因rs10889677位点多态性与乳腺癌发病相关。Park等[12]对IL-23R多态性(rs7530511)与韩国人脑出血的关系进行研究，发现等位基因频率与脑出血相关，表明IL-23R可能促进了脑出血的发展。Lee等[13]对IL-23R、IL-12B多态性与牛皮癣易感性之间的关联性进行了Meta分析，结果也提示欧洲人IL-23R rs7530511位点多态性与牛皮癣存在相关性。

本研究显示，不同性别广西壮族人群IL-23R rs10889677、rs7530511位点基因型和等位基因频率比较均无统计学意义，说明该位点基因型分布可能与性别无关。本研究还显示，广西壮族人群与日本、墨西哥、印第安人群比较，IL-23R基因rs10889677位点AA、AC、CC基因型频率和A、C等位基因频率有差异；与北京人群比较，等位基因频率有差异。广西壮族人群与北京、墨西哥、印第安人群比较，IL-23R基因rs7530511位点CC、CT、TT基因型频率和C、T等位基因频率比较有差异；与日本人群比较，基因型频率有差异。这也符合“亲缘关系越近，其基因型分布越相似，反之则差异显著”的遗传学规律。可见不同的地域、种族之间的遗传存在差异性，这些差异性可能导致某些疾病的高发、难治愈，这为今后进一步研究广西壮族人群中某些特异性高发疾病与IL-23R基因多态性之间的关系提供了参考。

[1] Oppmann B, Lesley R, Blom B, et al. Novel p19 protein engages IL-12p40 to form a cytokine, IL-23, with biological activities similar as well as distinct from IL-12[J]. Immunity, 2000,13(5):715-725.

[2] Parham C, Chirica M, Timans J, et al. A receptor for the heterodimeric cytokine IL-23 is composed of IL-12Rbeta1 and a novel cytokine receptor subunit, IL-23R[J]. J Immunol, 2002,168(11):5699-5708.

[3] Fischer S, Kvesdi E, Magyari L, et al. IL23R single nucleotide polymorphisms could be either beneficial or harmful in ulcerative colitis[J]. World J Gastroenterol, 2017,23(3):447-454.

[4] Zhu KJ, Zhu CY, Shi G, et al. Association of IL23R polymorphisms with psoriasis and psoriatic arthritis: a meta-analysis[J]. Inflamm Res, 2012,61(10):1149-1154.

[5] Hu WH, Chen HH, Yen SL, et al. Increased expression of interleukin-23 associated with progression of colorectal cancer[J]. J Surg Oncol, 2017,115(2):208-212.

[6] 覃彦平,秦雪.IL-23R基因多态性及其与疾病易患性的研究进展[J].医学综述,2012,18(16):2564-2567.

[7] Croxford AL, Mair F, Becher B. IL-23: one cytokine in control of autoimmunity[J]. Eur J Immol, 2012,42(9):2263-2270.

[8] 田红岭,侯玉柱,王若雨,等.IL-23生理病理学意义及信号通路[J].免疫学杂志,2014,30(6):555-559.

[9] Vignali DA, Kuchroo VK. IL-12 family cytokines: immunological playmakers[J]. Nat Immunol, 2012,13(8):722-728.

[10] 蒋刈,戴朴,韩东一.单核苷酸多态性在人类基因组学发展中的应用[J].中华耳科学杂志,2017,15(2):239-244.

[11] Tang T, Xue H, Cui S, et al. Association of interleukin-23 receptor gene polymorphisms with risk of bladder cancer in Chinese[J]. Fam Cancer, 2014,13(4):619-623.

[12] Park HJ, Su KK, Park HK, et al. Association of IL23R, polymorphism (rs7530511) with intracerebral hemorrhage in Korean population[J]. Neurol Sci, 2016,37(6):983-985.

[13] Lee YH, Song GG. Associations between interleukin-23R and interleukin-12B polymorphisms and psoriasis susceptibility: a meta-analysis[J]. Immunol Invest, 2013,42(8):726-736.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.016

R331.1

B

1002-266X(2017)47-0053-03

国家自然科学基金应急管理项目(81541136)。

唐毓金(E-mail: tangyujin196709@163.com)

2017-07-18)