中间丝聚合蛋白基因多态性与特应性皮炎发病及临床表型的相关性

张卉 程茹虹 李明 姚志荣

200092上海交通大学医学院附属新华医院皮肤科

·论著·

中间丝聚合蛋白基因多态性与特应性皮炎发病及临床表型的相关性

张卉 程茹虹 李明 姚志荣

200092上海交通大学医学院附属新华医院皮肤科

目的探讨中间丝聚合蛋白（FLG）基因多态性与特应性皮炎（AD）发病及临床表型的相关性。方法采用问卷调查的形式收集261例AD患者伴发过敏性鼻炎、哮喘病史和疾病严重度评分等资料，对部分患者进行混合食物过敏原和混合吸入性过敏原筛选、血清总IgE抗体和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白水平检测。采用重叠PCR和DNA测序法对上述AD患者和276例健康对照FLG基因3号外显子17个多态性位点（R444G、T454A、P478S、H519N、D836D、S1482Y、A1805V、R1891Q、1961Q、S2166S、Y2194H、H2330H、D2339N、S2366T、E2398Q、K2444E、E2652D）进行基因分型。结果二项逻辑回归分析和卡方检验未发现17种FLG多态位点与AD发病相关（均P＞0.05）。H519N与AD伴发哮喘相关（χ2=8.680，P=0.011），AA基因型可增加AD患者发生哮喘的风险（P=0.004，OR=1.061，95%CI1.016～1.109）。S2366T和K2444E与AD患者食物敏感相关（χ2值分别为6.520和6.121，P值分别为0.038和0.047），S2366T的GG+GC基因型（P=0.012，OR=1.396，95%CI1.054～1.849）和G等位基因（P=0.037，OR=1.350，95%CI1.008～1.807）可提高AD患者食物敏感的风险。K2444E的AA+AG基因型（P=0.013，OR=1.393，95%CI1.049～1.850）和G等位基因（P=0.028，OR=1.380，95%CI1.025～1.857）可提高AD患者食物敏感的风险。结论中国汉族人群FLG基因多态性可能是一些AD相关临床表型的危险因素，H519N可能与AD伴发哮喘相关，S2366T和K2444E则可能与AD伴食物敏感相关。

皮炎，特应性；中间丝蛋白质类；多态性，单核苷酸；食物过敏；表型；中间丝聚合蛋白基因

特应性皮炎（AD）的发病机制尚不明确，由中间丝聚合蛋白（filaggrin，FLG）基因突变导致的皮肤屏障功能缺陷被认为是AD发病的一个重要因素［1⁃2］。FLG功能缺失突变可增加AD患者对变应原的敏感性及发生过敏性鼻炎和哮喘的风险［3］，并可增加儿童和青少年患者的哮喘严重程度［4］。有研究表明，除FLG突变外，其单核苷酸多态性（SNP）也是AD发病的危险因素之一［5⁃8］。在前期研究中，我们已经完成对261例中国汉族AD患者FLG全基因测序，明确FLG突变与AD发病相关，同时也是AD患者发生食物敏感的一个危险因素［9］，而关于FLG基因多态性与AD及其相关临床表型的关系尚不明确。本研究目的是分析FLG 17个多态位点与AD及其相关临床表型的相关性。

对象与方法

一、对象

261例散发的中国汉族AD患者和276例健康对照参与本研究。所有AD患者均于2008—2009年就诊于上海交通大学医学院附属新华医院皮肤科门诊，符合Hanifin⁃Rajak诊断标准［10］。本研究通过上海交通大学医学院附属新华医院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

二、方法

1.数据采集：采用问卷调查形式收集数据。AD疾病严重度评分采用SCORAD评分系统［11］。哮喘和过敏性鼻炎的诊断基于既往病史和由内科或耳鼻咽喉科医生做出的诊断。采用UniCAP⁃100自动免疫分析仪（Phadia AB，瑞典法玛西亚公司）检测部分AD患者血清总IgE、血清嗜酸性阳离子蛋白（ECP）和特异性IgE抗体［混合吸入性过敏原hx2（包括户尘螨、粉尘螨、屋尘和蟑螂）和混合食物过敏原fx5E（包括鸡蛋白、牛奶、鳕鱼、小麦、花生和黄豆）］水平。

2.基因分型：采用血液基因组DNA提取试剂盒（北京Tiangen公司）提取受试者外周血全血基因组DNA。采用重叠PCR、基因测序对17个FLG多态位点（R444G，G/A；T454A，A/G；P478S，C/T；H519N，C/A；D836D，T/C；S1482Y，C/A；A1805V，C/T；R1891Q，G/A；H1961Q，C/A；S2166S，T/C；Y2194H，T/C；H2330H，C/T；D2339N，G/A；S2366T，G/C；E2398Q，G/C；K2444E，A/G；E2652D，A/C）进行基因分型。PCR引物和反应条件参照文献［12］。使用Applied Biosystems 3730 DNA分析仪（美国ABI公司）进行基因分型。

3.统计分析：采用SPSS21.0软件包。计量资料以±s表示。二项逻辑回归分析和χ2检验分析17个FLG多态位点基因型与AD发病以及临床表型的相关性。单因素方差分析比较不同基因型患者组SCORAD、血清总IgE和ECP水平的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般资料

261例AD患者中，男147例，女114例，年龄0.5～57.8（7.11±8.39）岁。234例（89.7%）早年（2岁前）发病，发病年龄0.02～36.0（1.46±4.40）岁。29例伴寻常型鱼鳞病，121例（46.4%）伴哮喘，112例（42.9%）伴过敏性鼻炎。72.3%（162/224）血清总IgE升高（＞ 100 IU/ml），96.6%（170/176）血清ECP升高（＞ 8 μg/L），63.8%（120/188）fx5E试验阳性，67.2%（125/186）hx2试验阳性。25例（9.6%）SCORAD评分为轻度（0～24分），182例（69.7%）中度（25～50分），54例（20.7%）重度（51～103分）。

276例健康对照均不伴有寻常型鱼鳞病，其中男182例，女94例，年龄0.2～ 20（13.24±3.89）岁。AD组和对照组性别（χ2=5.23，P＜0.05）和年龄（t=-10.764，P＜ 0.05，95%CI：-7.249 ～ -5.009）差异有统计学意义。

二、FLG SNP与AD发病及临床表型的相关性

单因素逻辑回归分析显示，17个FLG SNP中H519N（P=0.016，OR=1.955，95%CI1.133 ～3.372）和 E2398Q（P=0.009，OR=4.572，95%CI1.461～14.307）与AD发病相关。进一步多因素逻辑回归分析显示，二者与AD发病均无关（P＞0.05）。卡方检验显示，17个FLG SNP与AD发病均无显著相关性（P＞0.05），其中P478S SNP与AD发病的关系见表1。

表1 中间丝聚合蛋白基因P478S与特应性皮炎（AD）的相关性［例（%）］

对AD相关临床表型与17个FLG SNP相关性进一步分析，发现H519N与AD伴发哮喘相关（χ2=8.680，P=0.011），其AA基因型在AD伴发哮喘患者组中比例显著高于AD不伴发哮喘组（P=0.004），而A等位基因频率在两组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。未发现FLG SNP不同基因型与AD伴发过敏性鼻炎之间存在相关性（P＞0.05）。S2366T和K2444E与AD患者食物敏感相关（χ2值分别为6.520和6.121，P值分别为0.038和0.047）。S2366T位点 GG+GC基因型（P=0.012，OR=1.396，95%CI：1.054～ 1.849）、G等位基因频率在AD伴有食物敏感组均显著高于AD不伴有食物敏感组；K2444E位点AA+AG基因型（P=0.013，OR=1.393，95%CI：1.049 ～ 1.850）和G等位基因频率在AD伴有与不伴有食物敏感组间差异有统计学意义。见表3，4。未发现FLG SNP不同基因型与吸入物敏感间存在相关性（均P＞0.05）。

表2 中间丝聚合蛋白基因H519N与特应性皮炎（AD）伴发哮喘的相关性［例（%）］

表3 中间丝聚合蛋白基因S2366T与特应性皮炎伴发食物敏感的相关性［例（%）］

表4 中间丝聚合蛋白基因K2444E与特应性皮炎伴发伴发食物敏感的相关性［例（%）］

χ2检验显示，FLG SNP与AD早年发病无相关性（均P＞0.05）。单因素方差分析亦未发现FLG SNP不同基因型患者组间SCORAD评分、血清总IgE水平和ECP水平差异有统计学意义（P＞0.05）。

讨 论

已有多项研究报道，FLG SNP可能与突变一样，是AD发病的一个危险因素。Kim等［6］研究发现，FLG P478S TT+TC基因型与AD发病相关。Wang等［5］发现，P478S不仅是AD发病的危险因素，同时也是AD患者伴发哮喘的危险因素。本研究表明，中国汉族AD人群中FLG SNP与一些AD相关临床表型如哮喘、食物敏感相关，同时也证实，FLG SNP的分布特点与FLG突变一样存在种族差异。本研究中研究对象包括261例AD和276例健康对照者，尽管统计发现两组之间性别和年龄差异有统计学意义，但进一步对性别进行分层分析，在男女性组内均未发现SNP与AD发病相关，与不分层统计分析结果一致，因此可视为性别差异对本研究无影响。而且，由于检测的是基因多态性，这一数据不会随着年龄的增长而变化，因此认为年龄不会对研究产生影响。

在FLG的多态性位点中，P478S是NCBI数据库中最常见、被研究最多的一个SNP，且已被多项研究证明与AD发病相关，因此认为可将P478S作为AD高危人群的一个筛选工具。而在我们的研究中，未能得到类似的研究结果，其TT+TC基因型、T等位基因频率在AD组和对照组间均无显著性差异，提示FLG SNP分布在不同种族人群中存在很大差异，未来仍需对来自不同地区的大样本AD人群进一步研究来确定中国AD人群的高危SNP。

以往有研究认为维持婴儿期皮肤屏障功能的完整能阻止过敏性进程中其他过敏性气道疾病的发生［13］。Hudson等［14］报道FLG功能缺失突变是AD伴发哮喘的一个危险因素，而不是非AD患者发生哮喘的危险因素，这也强调了皮肤屏障功能在发生变应原致敏过程中的重要性。本次研究发现，FLG H519N可能是AD伴发哮喘的一个危险因素，携带H519N AA基因型的AD患者伴发哮喘的概率显著高于携带CC+CA基因型者。Wang等［5］对中国台湾116例儿童AD患者和212例正常对照进行分析，未发现H519N与AD发病以及伴发哮喘相关，提示H519N可能是中国大陆人群AD伴发哮喘患者的一个危险因素。我们的结果提示，对AD患者而言，确定有意义的FLG多态性和FLG无义或缺失突变同样重要。通过确定有效的分子标志来筛选AD伴发哮喘的高危人群从而实现早期临床干预，对于延缓甚至阻止过敏性进程中其他气道过敏性疾病的发生有重要意义。

我们还发现两个与AD食物敏感相关的FLG SNP即S2366T和K2444E。已知FLG基因主要表达于表皮和口腔、鼻黏膜，其终产物FLG是形成皮肤屏障的重要蛋白。Wang等［5］的研究表明，机体暴露于各种变应原后可能通过调控IgE水平改变易感机体发生AD的风险。尽管本次研究未发现FLG多态性与IgE水平之间的相关性，未来仍需更大样本的研究来进一步明确FLG多态性与血清总IgE水平以及sIgE水平之间的关系。

FLG SNP对终产物FLG的结构或功能的影响目前尚不清楚，其中P478S的作用机制目前也仅限于推测［10］，P478S以及其他SNP在AD发病机制中的作用及其机制均有待于进一步研究。

综上所述，我们在AD群体中确定了一些可能导致对AD相关临床表型如哮喘、食物敏感等易感的FLG多态性位点，这些位点是否以及如何改变FLG的结构或功能而发挥作用仍需进一步研究。

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Association of polymorphisms in the filaggrin gene with the occurrence and clinical phenotypes of atopic dermatitis

Zhang Hui,Cheng Ruhong,Li Ming,Yao Zhirong
Department of Dermatology,Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200092,China

Yao Zhirong,Email:zryaoxh@sina.com

ObjectiveTo investigate the association of polymorphisms in the filaggrin（FLG）gene with the occurrence and clinical phenotypes of atopic dermatitis（AD）.MethodsA questionnaire survey was carried out to collect data from 261 patients with AD,including the diagnosis of allergic rhinitis and asthma,and the severity of AD.Mixed food allergen screening test and mixed inhaled allergen screening test were performed in a part of patients,so was the detection of total serum IgE and eosinophil cationic protein（ECP）.Among the above AD patients and 276 healthy controls,17 polymorphic sites in exon 3 of the FLG gene,including R444G,T454A,P478S,H519N,D836D,S1482Y,A1805V,R1891Q,1961Q,S2166S,Y2194H,H2330H,D2339N,S2366T,E2398Q,K2444E and E2652D,were genotyped by overlapping PCR and DNA sequencing.ResultsBinary logistic regression analysis and chi⁃square test showed no correlations between the 17 polymorphic sites in the FLG gene and the occurrence of AD（allP＞ 0.05）.However,the H519N polymorphic site was associated with AD complicated by asthma（χ2=8.680,P=0.011）,and the AA genotype of H519N could increase the risk of asthma in the AD patients（P=0.004,OR=1.061,95%CI:1.016-1.109）.The S2366T and K2444E polymorphic sites were associated with food sensitization in the AD patients（χ2=6.520,6.121,P=0.038,0.047,respectively）,and the GG+CG genotype of S2366T（P=0.012,OR=1.396,95%CI:1.054-1.849）and its G allele（P=0.037,OR=1.350,95%CI:1.008-1.807）both could increase the risk of food sensitization in the AD patients.Similarly,the AA+GA genotype of K2444E（P=0.013,OR=1.393,95%CI:1.049-1.850）and its G allele（P=0.028,OR=1.380,95%CI:1.025-1.857）could increase the risk of food sensitization in the AD patients.ConclusionsThe FLG polymorphisms may be predisposing factors for some AD⁃related clinical phenotypes in Chinese Han population.The H519N gene may be associated with AD complicated by asthma,and the S2366T and K2444E genes may be related to food sensitization in AD patients.

Dermatitis,atopic;Intermediate filament proteins;Polymorphism,single nucleotide;Food hypersensitivity;Phenotype;Gene,filaggrin

姚志荣，Email：zryaoxh@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.11.007

2017⁃05⁃22）

尚淑贤）