两个隐性营养不良型大疱性表皮松解症家系COL7A1基因突变分析及产前诊断

徐哲 林志淼

100045北京，国际儿童医学中心 首都医科大学附属北京儿童医院皮肤科（徐哲）；北京大学第一医院皮肤科（林志淼）

·论著·

两个隐性营养不良型大疱性表皮松解症家系COL7A1基因突变分析及产前诊断

徐哲 林志淼

100045北京，国际儿童医学中心 首都医科大学附属北京儿童医院皮肤科（徐哲）；北京大学第一医院皮肤科（林志淼）

目的检测2个隐性营养不良型大疱性表皮松解症家系COL7A1基因突变情况，并在患儿母亲再次妊娠时进行胎儿产前诊断。方法收集2例隐性营养不良型大疱性表皮松解症患儿临床资料，提取患儿及其父母的外周血DNA，应用PCR扩增COL7A1基因的全部118个外显子并测序；用100例无血缘关系的健康人外周血作对照。确定致病突变后，在患儿母亲再次妊娠时，羊膜腔穿刺术获取羊水细胞。分别自直接抽提的羊水细胞以及培养后的羊水细胞中提取基因组DNA进行扩增和测序，检测COL7A1基因突变，同患儿的检测结果进行比较，行产前诊断。胎儿娩出后抽取静脉血，检测COL7A1基因突变。所有测序结果都经过双向测序验证。结果2例患儿均发现COL7A1基因复合杂合突变。例1 COL7A1基因存在c.5453G＞A及c.6781C＞T复合杂合突变，分别导致编码氨基酸发生p.G1818D突变和产生提前终止密码p.R2261Efs*25，其中c.5453G＞A来自父亲，c.6781C＞T来自母亲。例2 COL7A1基因存在c.6205C＞T及c.8272_8272delG复合杂合突变，导致编码蛋白发生p.R2069C及p.V2758Sfs*28复合杂合突变，其中c.6205C＞T来自父亲，c.8272_8272delG来自母亲。2例患儿的母亲再次怀孕时所取羊水细胞及羊水培养细胞均未测到患儿所携带的COL7A1基因突变。胎儿出生后皮肤黏膜正常，无水疱，基因检测亦未发现患儿所携带的COL7A1基因突变。结论2例营养不良型大疱性表皮松解症患儿均存在COL7A1基因复合杂合突变，并成功在2例患儿的母亲再次妊娠时进行了产前诊断。

营养不良性大疱性表皮松解；产前诊断；DNA突变分析；胶原Ⅶ型；COL7A1基因

隐性营养不良型大疱性表皮松解症（recessive dystrophic epidermolysis bullosa， RDEB， OMIM 609638）是一种常染色体隐性遗传的大疱性皮肤病，是遗传性大疱性表皮松解症中严重的类型之一，由COL7A1基因突变导致其编码的Ⅶ型胶原合成异常所致。患儿出生后即有皮肤脆性增加，以周身出水疱、糜烂、粟丘疹及愈后留下萎缩性瘢痕为特点［1］。对严重威胁到患者生命的RDEB而言，不但需要减少严重后遗症的发生，更应设法阻止疾病在家族中遗传。本研究中，我们对2例RDEB患儿进行基因检测，并在患儿母亲再次妊娠时进行产前诊断，阻断疾病向下一代传递。

病历资料

2例RDEB患儿均为散发病例，家族中未见类似患者，患儿父母临床表型正常，非近亲婚配。例1为2岁男童，出生时即有双下肢广泛皮肤缺失，累及小腿至足背（图1），生后1周开始于颈部、臀部和四肢出现水疱和血疱。1岁后手足因萎缩性瘢痕而活动受限。口腔中亦反复发生水疱、大疱和糜烂，偶有呕吐伴有声嘶，手足甲板大部分脱落，毛发稀疏。生长发育水平处于同龄儿童低限，曾在当地行皮肤病理和电镜检查，诊断为大疱性表皮松解症。例2为7岁女童，生后不久在腹部和面部各出现1处直径4 cm皮肤缺失，出生后第2天开始吸吮母乳后口唇部位出现水疱，3 d后手背及足跟处出现水疱、大疱，易破溃糜烂。很快以腹部和腰部为主，周身广泛出现水疱样皮疹，指、趾甲经常脱落。3岁后，症状有所减轻，限于腋下、腹部和口周，可见数个水疱（图2）。口腔及食道黏膜偶有破溃。智力及体格发育正常。

对水疱皮损行病理检查，2例患儿均表现为棘层增厚，表皮下裂隙，真皮层纤维增生伴有淋巴细胞为主的炎症细胞浸润。结合临床病史分析，2例患儿产科诊断为先天性皮肤缺损待查，临床诊断为RDEB。

图1 例1出生时胫骨前至足背皮肤缺失，上覆渗出性血痂

图2 例2腹部及腹股沟处见瘢痕，其上见水疱及糜烂

方 法

1.外周血DNA提取：本研究通过国际儿童医学中心首都医科大学附属北京儿童医院医学伦理委员会批准，在患儿母亲计划再次怀孕的半年前左右，取得患儿及其家属的知情同意后，取患儿及其父母静脉血4 ml置于乙二胺四乙酸抗凝管中，以QIAamp DNA Blood Mini试剂盒提取外周血基因组DNA。同时，在本院健康体检者中随机选取100例无关健康人，抽取外周血作为对照标本，提取标本DNA。

2.COL7A1基因外显子PCR扩增：在UCSC数据库中查取COL7A1基因的外显子序列，根据文献［2］，应用Primer5.0软件对COL7A1基因的所有118个外显子设计72对引物对其进行扩增，包括所有外显子的编码序列及侧翼序列。PCR扩增体系为25 μl，含12.5 μl Takara premix PCR热启动酶（日本Takara公司产品），正反向引物各1 pmol，模板DNA 30 ng。PCR反应条件：98℃预变性5 min，98℃变性60 s、60℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环35次，72℃延伸7 min。15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收特异性目的条带。

3.DNA测序：由北京天一辉远生物科技有限公司对所得PCR产物测序，扩增片段均行正反向引物测序。将所有测序结果与Ensembl网站（http：//www.ensembl.org/index.html）公布的COL7A1基因序列进行对照。

4.羊水细胞培养：对例1的母亲（于孕14周）和例2的母亲（于孕16周）分别行羊膜腔穿刺术，取羊水40 ml，20 ml用于直接抽提胎儿基因组DNA，20 ml用于细胞贴壁培养，以去除穿刺术过程中可能的母体细胞污染。羊水抽出后，室温下500×g离心6 min，取沉淀物加入10 ml培养液（L⁃DMEM+10%胎牛血清 +100 U/ml青霉素钾 +100 μg/ml链霉素）、100 μl羊水细胞培养添加剂，制成细胞悬液，接种至直径100 mm培养皿，置于37℃、5%C02培养箱中原代培养。静置5 d后，无菌PBS漂洗传代扩增，每3天更换培养液并传代1次，传代3次后，分离羊水培养细胞。

5.羊水及羊水培养细胞中COL7A1基因突变检测：使用InstaGene Matrix试剂（美国 Bio⁃Rad公司）提取羊水及羊水培养细胞中胎儿DNA，通过PCR扩增和测序检测COL7A1基因突变，步骤同“2.COL7A1基因外显子PCR扩增”。

6.胎儿COL7A1基因突变检测：2例患儿母亲娩出胎儿后，取胎儿静脉血，提取DNA，检测COL7A1基因突变，步骤同“1.外周血DNA提取”和“2.COL7A1基因外显子PCR扩增”，将所得结果与患儿结果比对。

结 果

1.PCR及产物电泳结果：患儿及其父母的静脉血、羊水细胞、羊水培养细胞及娩出胎儿的静脉血标本经PCR扩增后电泳，均在特定泳道内见到与预期片段长度相同的明亮条带。100例无关健康对照标本均能扩增出与第63、86、39和111号外显子片段长度对应的明亮条带。

2.患儿测序结果：2例患儿均发现COL7A1基因复合杂合突变。例1 COL7A1基因第63号外显子存在c.5453G＞A错义突变，导致相应编码氨基酸出现p.G1818D替代；第86号外显子存在c.6781C＞T错义突变，使氨基酸出现p.R2261*改变，产生终止密码子，导致蛋白质翻译提前终止。例2 COL7A1基因第39号外显子存在c.6205C＞T错义突变，编码氨基酸出现p.R2069C替代；第111号外显子存在c.8272_8272delG突变，导致编码氨基酸出现p.V2758Sfs*28改变。所有突变测序结果都经过正反向测序得到验证。100例无关健康人未发现COL7A1基因突变。见图3、4。

3.患儿父母测序结果：例1 c.5453G＞A突变来自父亲，c.6781C＞T突变来自母亲。例2 c.6205C＞T突变来自父亲，c.8272_8272delG突变来自母亲。2例患儿父母均为携带相应突变的杂合子。

4.羊水细胞及羊水培养细胞基因测序结果：从例1、2的母亲再次妊娠时抽取的羊水细胞及羊水培养细胞均未检测到COL7A1基因突变。

图3 隐性营养不良型大疱性表皮松解症患儿COL7A1基因突变 3A、3B：例1的c.5453G＞A和c.6781C＞T突变；3C、3D：例2的c.6205C＞T和c.8272_8272delG突变。箭头示突变位点

图4 健康对照COL7A1基因PCR产物部分测序结果 4A～4D：健康对照在图3A～3D所示区域的测序结果。箭头示与患儿突变位点对应的正常位点

5.娩出胎儿突变检测结果：2例患儿母亲均分娩出临床表型正常的新生儿，后续基因检测示胎儿均未携带COL7A1基因突变。

讨 论

目前，已报道的引起RDEB的突变包括错义突变、移码突变以及剪切位点突变等［3］。其中，在COL7A1基因编码的Ⅶ型胶原三螺旋区位置引起甘氨酸替代的杂合错义突变为RDEB最常见的基因突变。这是由于Ⅶ型胶原蛋白的结构特征是Gly⁃Xaa⁃Yaa连续重复，甘氨酸是最小的氨基酸，对于胶原蛋白的结构和功能至关重要。当甘氨酸被其他种类的氨基酸替代后，可能干扰Ⅶ型胶原的三螺旋结构域形成，妨碍其结构的完整性和稳定性，使皮肤基底膜致密板下带锚纤维（其主要成分为Ⅶ型胶原）不能维持正常功能，导致RDEB发生［4⁃5］。

本研究明确了2例RDEB患儿的COL7A1基因突变位点，并在此基础上用羊水细胞培养的方法对患儿母亲，即COL7A1基因突变的携带者进行产前诊断，阻断疾病在家系中向下一代遗传。该2例患儿中，例1出生时双小腿皮肤剥脱，与先天性皮肤发育不全、局限性真皮发育不良类似。所以临床遇到类似皮疹表现的婴儿时，应详细询问患儿出生时是否有水疱或皮肤剥脱等皮疹表现，对其进行长期随访，以鉴别不同类型的表皮松解症。当高度怀疑患儿为重度RDEB时，直接进行基因测序确诊更为经济、高效和合理［6］。c.6781C ＞ T和c.8272_8272delG突变都会导致终止密码子出现，这种突变直接可以确定为致病性突变。此外，c.6205C＞T错义突变是HGMD 网站（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）报告过的突变位点，可使氨基酸出现p.R2069C突变。c.5453G＞A导致的p.G1818D虽然没有报道过，但其是位于Ⅶ型胶原结构Gly⁃X⁃Y的甘氨酸突变，也是COL7A1最常见的致病性突变类型，综上所述，可以确定两个家系的突变位点都是致病性的。例2在生后和婴儿期发生皮肤黏膜广泛水疱，但在3岁后，水疱部位发生转变，逐渐集中并局限于腋下、腹股沟等皮肤皱褶处。结合其突变位点（包括c.6205C＞T），例2应被诊断为反向型RDEB（recessive dystrophic epidermolysis bullosa⁃inversa，RDEB⁃I，OMIM 226600）。虽然此型RDEB患者皮疹逐步向皱褶部位转移的原因不明，但c.6205C＞T几乎是本型特有的COL7A1基因突变位点［7］。类似皮疹分布的疾病还有家族性良性天疱疮，可能是因为褶皱部位局部皮肤温度较高，蛋白酶降解速度与其他部位存在差异。

对于父母为COL7A1致病基因突变携带者的家庭而言，如果母亲再次怀孕，胎儿有25%患本病的风险。REDB作为隐性遗传病，患者具有复合杂合突变，而如果患者配偶不携带COL7A1基因突变，则后代为携带者，不表现出该疾病。由于已经明确基因突变位点，有再发风险的胎儿可在母亲孕期进行羊水穿刺（最佳的羊膜腔穿刺时间是怀孕14～20周）及产前诊断，避免再次分娩出类似疾病的患儿。

［1］Jiang W,Sun TT,Lei PC,et al.Genotype⁃phenotype correlation in Chinese patients with dystrophic epidermolysis bullosa prurigi⁃nosa［J］.Acta Derm Venereol,2012,92（1）:50⁃53.DOI:10.2340/00015555⁃1178.

［2］Christiano AM,Hoffman GG,Zhang X,et al.Strategy for identifi⁃cation of sequence variants in COL7A1 and a novel 2⁃bp deletion mutation in recessive dystrophic epidermolysis bullosa［J］.Hum Mutat,1997,10（5）:408⁃414.DOI:10.1002/（SICI）1098⁃1004（1997）10:5＜408::AID⁃HUMU12＞3.0.CO;2⁃3.

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［6］姜薇,杨勇,朱学骏,等.痒疹样营养不良型大疱性表皮松解症一家系的基因突变［J］.中华皮肤科杂志,2002,35（6）:442⁃444.DOI:10.3760/j.issn:0412⁃4030.2002.06.007.

［7］Shimizu H,Hammami⁃Hauasli N,Hatta N,et al.Compound heterozygosityforsilentand dominantglycinesubstitution mutations in COL7A1 leads to a marked transient intracyto⁃plasmic retention of procollagen VII and a moderately severe dystrophic epidermolysis bullosa phenotype［J］.J Invest Dermatol,1999,113（3）:419⁃421.DOI:10.1046/j.1523⁃1747.1999.00713.x.

Mutation analysis of the COL7A1 gene and prenatal diagnosis in two families with recessive dystrophic epidermolysis bullosa

Xu Zhe,Lin Zhimiao
Department of Dermatology,Beijing Children′s Hospital,Capital Medical University,National Center for Children′s Health,Beijing 100045,China（Xu Z）;Department of Dermatology,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China（Lin ZM）

Xu Zhe,Email:zhexu_cmu@163.com

ObjectiveTo detect mutations of the COL7A1 gene in 2 families with recessive dystrophic epidermolysis bullosa（RDEB）,and to perform prenatal diagnosis during the pregnancy of patients′mothers.MethodsClinical data were collected from 2 patients with RDEB.DNA was extracted from the peripheral blood samples from the patients,their parents and 100 unrelated healthy people who served as controls.PCR was performed to amplify all the 118 exons of the COL7A1 gene followed by DNA sequencing.After identification of pathogenic mutations,amniotic fluid cells were obtained by amniocentesis during the next pregnancy of the patients′mothers,and genomic DNA was extracted from uncultured or cultured amniotic fluid cells followed by amplification and DNA sequencing to detect mutations in the COL7A1 gene.The results were compared with patients′results for prenatal diagnosis.After delivery,venous blood samples were collected from the neonates to detect mutations in the COL7A1 gene.All the results were verified by bidirectional sequencing.ResultsCompound heterozygous mutations in the COL7A1 gene were identified in the 2 patients.Two heterozygous mutations（c.5453G ＞A and c.6781C＞T）in the COL7A1 gene were found in case 1,which resulted in the p.G1818D mutation and the formation of a premature termination codon p.R2261Efs*25.Additionally,the c.5453G＞A and c.6781C＞T mutations were inherited from his father and mother respectively.Another 2 heterozygous mutations（c.6205C＞T and c.8272_8272delG）in the COL7A1 gene were identified in case 2,which led to the p.R2069C and p.V2758Sfs*28 mutations in encoded proteins,and the c.6205C＞T and c.8272_8272delG mutations were inherited from the patient′s father and mother respectively.None of the above mutations in the COL7A1 gene was found in the uncultured or cultured amniotic fluid cells,which were collected from the 2 patients′mothers during the next pregnancy.After birth,the neonates showed normal skin and mucosa without blisters,and genetic testing showed none of the above mutations in the COL7A1 gene in the neonates.ConclusionCompound heterozygous mutations in the COL7A1 gene were found in the 2 patients with RDEB,and prenatal diagnosis was successfully performed in the 2 patients′mothers during the next pregnancy.

Epidermolysis bullosa dystrophica;Prenatal diagnosis;DNA mutational analysis;Collagen type VII;Gene,COL7A1

Fund programs:Beijing Municipal Natural Science Foundation（7162060）;Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support（ZYLX201601）;Basic and Clinic Science Foundation of Capital Medical University（16JL22）;Maternal and Child Health Foundation of Shunyi Women and Children′s Hospital of Beijing Children′s Hospital（FYJK201601）

徐哲，Email：zhexu_cmu@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.11.009

北京市自然科学基金（7162060）；北京市医院管理局临床医学发展专项（ZYLX201601）；首都医科大学基础临床合作研究基金（16JL22）；北京儿童医院顺义妇儿医院妇幼健康基金（FYJK201601）

2017⁃04⁃13）

尚淑贤）