过敏性紫癜患者中性粒细胞及其IgA Fc受体对血管内皮细胞凋亡的影响及机制

陈静思 孙晨 阳海平 甘立强 谭春花 王华 罗晓燕

400014重庆医科大学附属儿童医院皮肤科（陈静思、甘立强、谭春花、王华、罗晓燕），儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室（孙晨），儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地（阳海平）

·论著·

过敏性紫癜患者中性粒细胞及其IgA Fc受体对血管内皮细胞凋亡的影响及机制

陈静思 孙晨 阳海平 甘立强 谭春花 王华 罗晓燕

400014重庆医科大学附属儿童医院皮肤科（陈静思、甘立强、谭春花、王华、罗晓燕），儿童发育疾病研究教育部重点实验室 儿科学重庆市重点实验室（孙晨），儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地（阳海平）

目的研究中性粒细胞及其IgA Fc受体（CD89）在过敏性紫癜（HSP）发病中的作用和对血管内皮细胞的损伤效应及调控机制。方法入组30例急性期HSP患儿及9例健康对照儿童，分离外周血中性粒细胞；Jacalin亲和层析分离HSP患者血清IgA后，采用聚丙烯葡聚糖凝胶纯化IgA。实时定量PCR（qPCR）、Western印迹分别检测中性粒细胞CD89 mRNA和蛋白表达，流式细胞仪分析中性粒细胞活化标志分子CD11b的表达。分别将HSP患儿中性粒细胞、健康对照中性粒细胞与血管内皮细胞HUVEC共培养，以HSP患儿血清分离的IgA（HSP IgA）、单体IgA（mIgA）、磷酸盐缓冲液（空白对照组）分别处理，流式细胞仪检测HUVEC细胞凋亡，ELISA检测上清液中白细胞介素8（IL⁃8）、肿瘤坏死因子α（TNF⁃α）水平。结果HSP患儿组中性粒细胞CD89 mRNA表达与健康对照组差异无统计学意义（P=0.98），但蛋白表达（0.60±0.16）低于健康对照组（0.83±0.24，P=0.03）。HSP患者中性粒细胞CD11b表达（1 880.25±388.29）显著高于健康对照组（1 109.25±364.25，P＜0.01）。与HSP患者中性粒细胞共培养组HUVEC凋亡率（37.44%±5.49%）高于与健康对照中性粒细胞共培养组（17.14%±4.45%，P＜0.01）。HSP IgA处理组HUVEC凋亡率明显高于mIgA处理组（均P＜0.01）和空白对照组（P＜0.01），且上清液中IL⁃8、TNF⁃α浓度明显高于mIgA处理组（均P＜0.01）和空白对照组（P值分别为0.01、0.02）。结论HSP患者外周血中性粒细胞活化，并可诱导血管内皮细胞凋亡。而且HSP IgA能促进中性粒细胞介导的血管内皮细胞凋亡和炎症因子IL⁃8、TNF⁃α分泌，而mIgA则可能具有一定抑制效应。

紫癜，过敏性；免疫球蛋白A；受体，Fc；中性白细胞；人脐静脉内皮细胞；凋亡；白细胞介素8；肿瘤坏死因子α

过敏性紫癜（Henoch Schönlein purpura，HSP）在组织病理上是一种累及小血管、以中性粒细胞浸润为主的白细胞碎裂性血管炎，其发病机制尚不完全清楚。有研究表明，氧化应激、脂质过氧化、中性粒细胞激活在发病中起重要作用［1］。中性粒细胞激活后可诱发氧化应激反应，释放髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO），产 生 活 性 氧 自 由 基（reactive oxygen species，ROS）等，参与对小血管的损伤［2］。中性粒细胞表面表达多种免疫识别受体，包括Toll样受体、补体受体、IgG Fc受体（FcγR）、IgA Fc受体（FcαR I/CD89）等，其中 IgA Fc受体（FcαR I/CD89）能通过2个胞外结合域与IgA的Fc段发生特异性高亲和力结合。IgA与Fc受体结合后吸引循环中抗IgA自身抗体（包括IgG与IgA）是循环免疫复合物形成的基础，并可激发吞噬、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）等［3］。目前中性粒细胞在HSP发病中的具体作用及机制仍不清楚。本研究拟观察急性HSP患儿外周血中性粒细胞活化及其IgA Fc受体CD89表达水平，构建HSP患者中性粒细胞与血管内皮细胞即人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养模型，评估IgA及Fc受体对共培养HUVEC细胞凋亡的影响，以阐明中性粒细胞参与HSP发病及其损伤血管内皮细胞的机制。

对象与方法

1.病例收集：2014年2月至2015年6月重庆医科大学附属儿童医院皮肤科门诊就诊的初发急性期HSP患儿30例，其中男19例，女11例，年龄（7.42±2.22）岁，均符合2006年欧洲风湿联合会（EULAR）HSP诊断标准［4］。9例健康体检儿童作为对照，其中男4例，女5例，年龄（8.46±2.36）岁，两组性别构成及年龄差异均无统计学意义（P＞0.05）。30例HSP患儿各取外周血3～5 ml，采用Percoll密度梯度离心法分离，每例约收获4×106～1×107中性粒细胞，其纯度＞90%，台盼蓝染色示细胞活力＞92%。其中，8例用于分离中性粒细胞检测CD11b及CD89表达，5例用于分离中性粒细胞与HUVEC共培养检测HUVEC凋亡，12例分离血清提取IgA，5例与HUVEC共培养并用不同类型IgA处理。健康对照组中，8例外周血分离中性粒细胞检测CD11b及CD89表达，5例分离的中性粒细胞与HUVEC共培养。本研究通过重庆医科大学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

2.材料：Nycoprep分离液（挪威Axis⁃shield公司），Jacalin亲和层析柱（美国Thermo公司），人单体IgA（mIgA，美国Abcam公司），胎牛血清（美国Gibco公司），HUVEC细胞株、异硫氰酸荧光素/碘化丙锭标记的膜联蛋白V（Annexin V⁃FITC/PI）、细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基公司），反转录试剂盒、荧光实时定量试剂盒（日本TakaRa公司），蛋白提取试剂盒、鼠抗人β肌动蛋白单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），鼠抗人CD11b单克隆抗体（美国BD公司），鼠抗人CD89单克隆抗体（美国AbD Serotec公司），FITC-羊抗鼠IgG二抗（美国Abcam公司），辣根过氧化物酶（HRP）-羊抗鼠IgG二抗（北京中山金桥公司），人白细胞介素8（IL-8）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒（美国R&D公司）。实时定量PCR仪（美国Bio⁃Rad公司），Western印迹凝胶成像仪（日本Fujifilm公司），BD FACS CantoⅡ流式分析仪（美国BD公司）。

3.实时定量PCR（qPCR）检测中性粒细胞CD89 mRNA表达：提取外周血中性粒细胞总RNA，反转录成 cDNA，行 qPCR，反应体积 20 μl，反应条件：95℃ 2 min，94 ℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 2 min，共30个循环。CD89：正向引物5′⁃GAGCACAGTCAGT AGACTTC⁃3′，反向引物5′⁃GATTCCGAGCGTGAGT CCA⁃3′；内参照β肌动蛋白：正向引物5′⁃TGGCACC CAGCACAATGAA⁃3′，反向引物5′⁃TGGAAGGTGGA CAGCGAGGC⁃3′。结果采用2⁃ΔΔCt表示，每个样本重复3次取平均值。

4.Western印迹检测中性粒细胞CD89蛋白表达：提取外周血中性粒细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS⁃PAGE），转膜并加入抗体反应，显影、定影，用凝胶图像处理系统分析目标条带的分子量和静吸光度。以CD89蛋白与β肌动蛋白的比值表示蛋白相对表达水平。

5.流式细胞仪检测中性粒细胞活化标志CD11b：分离外周血中性粒细胞，鼠抗人CD11b单克隆流式抗体染色后上机检测，藻红蛋白标记的鼠IgG1为阴性对照，每个样本设1个复孔，以平均荧光强度（MFI）表示CD11b表达量。

6.HSP患儿血清IgA（HSP IgA）提取和纯化［5］：采用Jacalin亲和层析柱法分离患者血清IgA，将洗脱液过聚丙烯葡聚糖凝胶Sephacryl 200层析柱，并收集第1峰洗脱液，BCA法测定浓度后备用。

7.中性粒细胞与血管内皮细胞共培养模型的构建及分组：取HUVEC铺6孔板（1.7×106细胞/孔），分别加入5例HSP患儿或5例健康对照外周血分离的中性粒细胞（5×105/孔），每个样本设1个复孔，于37℃孵箱共培养24 h后流式检测HUVEC凋亡率。再分别取5例HSP患儿、5例健康对照外周血中性粒细胞与HUVEC同上建立共培养模型，分为3组，每个样本设复孔，①空白对照组：向共培养体系中加入等体积PBS；②mIgA组：加入最适浓度mIgA；③HSP IgA组：加入最适浓度HSP IgA。IgA最适浓度确定：配制20、30、40、50 mg/L mIgA以及25、50、100、200 mg/L HSP IgA，分别加入共培养模型干预24 h，流式细胞仪检测HUVEC凋亡，经5次预实验确定mIgA最适浓度为40 mg/L，此时HUVEC早期凋亡率最低，HSP IgA最适浓度为100 mg/L，此时HUVEC早期凋亡率最高。

8.HUVEC凋亡检测：采用流式细胞仪分析。收集共培养的HUVEC和HSP中性粒细胞，以中性粒细胞CD11b为标记，采用阴选圈定HUVEC，Annexin V⁃FITC/PI Q4象限（Annexin V⁃FITC阳性，PI阴性）代表早期凋亡细胞。

9.ELISA法检测共培养模型上清液中IL⁃8、TNF⁃α水平：按试剂盒说明书进行。

10.统计学处理：Flowjo软件分析流式细胞仪检测数据，采用SPSS17.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以±s表示。计量资料两组间比较采用t检验，3组及以上组间比较用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异（LSD）法。计数资料比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.CD89 mRNA及蛋白表达：急性HSP患儿外周血中性粒细胞CD89 mRNA表达与健康对照组比较差异无统计学意义（P=0.98），而CD89蛋白表达显著低于健康对照组（P=0.03），见图1、表1。

2.CD11b表达：HSP患儿中性粒细胞CD11b MFI显著高于健康对照组（P＜0.01），见表1。

3.中性粒细胞对HUVEC凋亡的影响：与HSP患者中性粒细胞共培养的HUVEC凋亡率高于与健康对照中性粒细胞共培养组（P＜0.01），见表1。

图1 Western印迹检测中性粒细胞CD89蛋白表达 1～4：健康对照；5～8：过敏性紫癜患儿

表1 过敏性紫癜（HSP）患儿中性粒细胞CD89、CD11b表达水平及对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡的影响（±s）

表1 过敏性紫癜（HSP）患儿中性粒细胞CD89、CD11b表达水平及对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡的影响（±s）

注：aHUVEC凋亡率检测中两组例数均为5

组别健康对照组HSP组t值P值例数a 88 CD89 mRNA 1.11±0.12 1.11±0.04 0.02 0.98 CD89蛋白0.83±0.24 0.60±0.16 2.36 0.03 CD11b平均荧光强度1 109.25±364.25 1 880.25±388.29 4.10＜0.01 HUVEC凋亡率（%）17.14±4.45 37.44±5.49 6.43＜0.01

表2 HSP患者IgA和mIgA对共培养的血管内皮细胞凋亡及上清液中IL⁃8、TNF⁃α水平的影响（±s）

表2 HSP患者IgA和mIgA对共培养的血管内皮细胞凋亡及上清液中IL⁃8、TNF⁃α水平的影响（±s）

注：n=5。与HSP IgA组比较，aP ＜0.01，bP ＜0.05。HSP：过敏性紫癜；HUVEC：人脐静脉内皮细胞；IL⁃8：白细胞介素8；TNF⁃α：肿瘤坏死因子α

组别HSP IgA组mIgA组空白对照组F值P值HUVEC凋亡率（%）63.99±14.90 27.07±8.21a 34.90±7.99a 16.08＜0.01 IL⁃8（μg/L）8 423.99±2 659.48 3 135.36±1 153.84a 4 706.28±1 502.94b 10.34＜0.01 TNF⁃α（μg/L）275.98±40.39 168.49±48.16a 210.44±24.80b 9.64＜0.01

4.不同IgA处理对中性粒细胞与HUVEC共培养模型中HUVEC凋亡及上清液中IL⁃8、TNF⁃α水平的影响：HSP IgA组HUVEC平均凋亡率高于mIgA组（P＜0.01）及空白对照组（P＜0.01），mIgA组凋亡率低于空白对照组，但两组间差异无统计学意义（P=0.28）。HSP IgA组上清液中IL⁃8、TNF⁃α浓度均显著高于mIgA组（均P＜0.01）及空白对照组（P值分别为0.01、0.02），mIgA与空白对照组之间比较差异无统计学意义。见表2。

讨 论

中性粒细胞在HSP发病机制中具有重要意义。首先，HSP的病理基础是以中性粒细胞浸润为主的白细胞碎裂性血管炎，其次在免疫复合物介导的血管炎模型Arthus反应中，免疫复合物沉积导致补体活化和炎症细胞募集，而中性粒细胞活化和聚集是免疫复合物致血管损伤所必需的条件［6］。另外有研究发现，HSP患儿急性期皮损处趋化中性粒细胞黏附的细胞间黏附分子1（ICAM⁃1）、E选择素、P选择素水平明显上调，而ICAM⁃1、E选择素、P选择素配体下调可使中性粒细胞浸润明显减少，从而减轻水肿、出血等血管炎表现［7］。CD11b是中性粒细胞活化后表达的黏附分子，在静息状态下贮存于中性粒细胞胞质的三级颗粒中，在炎症状态下CD11b表达持续增加且分子活性增高，是中性粒细胞早期活化的特异性指标和HSP血管炎症产生的始动环节［8］。本研究证实，急性期HSP患儿中性粒细胞CD11b表达明显增高。我们还发现急性期HSP患儿外周血中性粒细胞CD89 mRNA表达正常，而蛋白水平较健康对照组降低。体外研究及多项疾病动物模型表明，CD89在介导血管炎症反应、组织免疫损伤中起重要作用，可通过配体IgA调控其在体内的功能［3］。在与HSP发病机制相似的IgA肾病患者中，中性粒细胞表面及胞质内CD89表达下调，推测可能与CD89在IgA作用下胞外段脱落至循环中导致效应细胞表面表达降低有关［9］。中性粒细胞表面CD89的持续下调可导致循环中IgA免疫复合物降解障碍，加剧循环中IgA免疫复合物的沉积［10］。

IgA是HSP重要的致病因素，血清IgA以mIgA、多聚IgA（pIgA）等多种形式共存，IgA受体CD89可能作为双功能受体发挥不同生理效应［11］。mIgA在无抗原刺激下能抑制多种炎症应答过程，而pIgA及免疫复合物则发挥促炎作用［12⁃14］。为进一步探讨不同类型IgA对HSP中性粒细胞介导的HUVEC凋亡的作用及可能机制，我们构建HSP中性粒细胞-HUVEC共培养炎症模型，分别用自HSP患儿分离的IgA（以pIgA为主）及mIgA干预，结果发现，pIgA可诱导中性粒细胞介导的HUVEC凋亡，而mIgA对凋亡显示出一定的抑制效应。中性粒细胞损伤血管内皮细胞可经由以下几种途径：血管内皮细胞激活，细胞因子、趋化因子、抗中性粒细胞胞质抗体、抗血管内皮细胞抗体，免疫复合物沉积及补体激活［15⁃16］。本研究发现，不同类型IgA对促炎症细胞因子IL⁃8、TNF⁃α的产生有不同影响：pIgA可诱导IL⁃8、TNF⁃α产生，而mIgA则显示出一定抑制作用。IL⁃8作为一种促炎症细胞因子和趋化因子能诱导骨髓中性粒细胞，并与中性粒细胞上受体结合后诱导其向血管内皮细胞移行和黏附，参与免疫复合物介导血管炎的发病［17］。

综上所述，本研究提示，HSP患儿血清IgA可能通过与中性粒细胞表面受体CD89结合，使中性粒细胞活化，进而导致血管内皮细胞损伤，CD89可能是HSP血管炎症调控的潜在靶点。

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Effect of neutrophils and their IgA Fc receptor on vascular endothelial cell apoptosis in patients with Henoch ⁃Schönlein purpura and its mechanism

Chen Jingsi,Sun Chen,Yang Haiping,Gan Liqiang,Tan Chunhua,Wang Hua,Luo Xiaoyan
Department of Dermatology,Children′s Hospital of Chongqing Medical University（Chen JS,Gan LQ,Tan CH,Wang H,Luo XY）;Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders,Chongqing Key Laboratory of Pediatrics,Chongqing 400014,China（Sun C）;China International Science and Technology Cooperation Base of Child Development and Critical Disorders,Chongqing 400014,China（Yang HP）

Luo Xiaoyan,Email:luoxycq@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the role of neutrophils and their IgA Fc receptor CD89 in the occurrence of Henoch⁃Schönlein purpura（HSP）,to evaluate their effects on vascular endothelial cell apoptosis,and to explore their mechanisms.MethodsPeripheral blood neutrophils were isolated from 30 children with acute HSP and 9 age⁃matched healthy controls separately.After isolation of serum IgA by Jacalin affinity chromatography,IgA was purified by polypropylene dextran gel chromatography.Real⁃time fluorescence⁃based quantitative PCR（qPCR）and Western blot analysis were performed to determine the mRNA and protein expression of CD89 on neutrophils respectively,and flow cytometry was conducted to measure the expression of neutrophil activation marker CD11b.Human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）were co⁃cultured with neutrophils isolated from patients with HSP（HSP group）and healthy controls（healthy control group）separately.Moreover,the HSP group were divided into 3 subgroups to be treated with serum IgA isolated from the HSP patients（HSP IgA group）,monomeric IgA（mIgA group）and phosphate⁃buffered saline（blank control group）respectively.Then,flow cytometry was conducted to detect apoptosis of co⁃cultured HUVEC,and enzyme⁃linked immunosorbent assay（ELISA）to measure levels of interleukin⁃8（IL⁃8）and tumor necrosis factor⁃alpha（TNF⁃α）in the supernatant of co⁃cultured cells.ResultsThere was no significant difference in the mRNA expression of CD89 on neutrophils between the patients with HSP and healthy controls（P=0.98）,but the protein expression of CD89 was significantly lower in the patients with HSP than in the healthy controls（0.60± 0.16vs.0.83± 0.24,P=0.03）.The expression of CD11b on neutrophils was significantly higher in the patients with HSP than in the healthy controls（1 880.25 ± 388.29vs.1 109.25 ± 364.25,P＜ 0.01）.The apoptosis rate of co⁃cultured HUVEC was also significantly higher in the HSP group than in the healthy control group（37.44% ±5.49%vs.17.14% ± 4.45%,P＜ 0.01）.In addition,the HSP IgA group showed significantly higher apoptosis rate of co⁃cultured HUVEC and levels of IL⁃8 and TNF⁃α in the supernatant compared with the mIgA group（allP＜0.01）and blank control group（P＜ 0.01,=0.01,=0.02,respectively）.ConclusionsPeripheral blood neutrophils in patients with HSP are activated,which can induce the apoptosis of vascular endothelial cells.HSP IgA can promote the neutrophil⁃mediated apoptosis of vascular endothelial cells and secretion of IL⁃8 and TNF⁃α,while mIgA may show a certain inhibitory effects.

Purpura,Schoenlein⁃Henoch;Immunoglobulin A;Receptors,Fc;Neutrophils;Human umbilical vein endothelial cells;Apoptosis;Interleukin⁃8;Tumor necrosis factor⁃alpha

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81301362）

罗晓燕，Email：luoxycq@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.11.005

国家自然科学基金（81301362）

2017⁃04⁃13）

尚淑贤）