一起山羊流产衣原体感染的诊断

吴浩阳，黄加利，徐 莹，孙 裴，付明哲*，许信刚*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036)

一起山羊流产衣原体感染的诊断

吴浩阳1,2，黄加利1，徐 莹1，孙 裴2，付明哲1*，许信刚1*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036)

陕西省某山羊养殖场发生了一起山羊流产病，经流行病学调查，临床症状和病理剖检观察进行初步诊断；利用布鲁菌虎红平板凝集试验、衣原体间接血凝试剂盒对10份流产母羊血清检测；对病料进行细菌学检测；依据GenBank收录的山羊流产性衣原体基因组设计1对特异性引物，通过PCR方法从病料中扩增衣原体特异性片段。结果表明，根据临床症状和病理变化初步怀疑为布鲁菌和鹦鹉热亲衣原体感染；10份血清检测结果为布鲁菌病血清全部阴性，衣原体感染血清全部为阳性；细菌学检测结果为阴性；PCR结果获得523 bp基因片段，测序结果与鹦鹉热亲衣原体100%相似。依据流行病学调查，临床症状和病理剖检观察，病原学和血清学诊断，最终确诊该病为鹦鹉热亲衣原体引起的山羊地方流行性流产。

山羊流产；鹦鹉热亲衣原体；诊断

山羊地方流行性流产是由布鲁菌和鹦鹉热亲衣原体引起的母羊繁殖障碍性疾病。衣原体是类似于细菌或病毒的一种微生物，既有RNA，又有DNA，是一类专门寄生在真核细胞内的革兰阴性微生物[1]，衣原体目包括3个科，即衣原体科、副衣原体科和西氏衣原体科。鹦鹉热亲衣原体属于衣原体科，在哺乳动物中已经分离到8～10种血清型，且主要存在于病鸟的体内，通过各种方式传播，病畜和病原携带者是本病的主要传染源，鸽子和麻雀也是本病的病原携带者，同时也能够引起妊娠猪、牛等多种动物发生流产[2]。鹦鹉热亲衣原体可感染母羊，并引起流产，首次发生流产的羊群流产率达20%～30%，流产过的母羊在下一次生产中，虽然不再发生流产，但产弱羔较多。弱羔表现神经症状、肺炎、关节炎或结膜炎等。在流产羊群中公羊出现睾丸炎和附睾炎[3]。2017年2～3月期间陕西某奶山羊养殖场中大量妊娠母羊出现流产、产死胎或者产出弱胎等症状。通过流行病学调查、临床症状观察、病理剖

检、流产母畜的血清学检测及鹦鹉热亲衣原体基因的PCR检测，确诊该起病为鹦鹉热亲衣原体引起的山羊流产性衣原体病，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床样品采集 无菌采集流产母羊的血液10份并分离血清，置-20℃冻存备用。无菌法采集流产胎儿的肺、脾、羊水和胎盘各3份，置-20℃冻存备用。

1.1.2 主要试剂 布鲁菌病虎红凝集试验抗原、阴性血清、阳性血清购于哈药集团；衣原体间接血凝试验检测试剂盒购于兰州兽医研究所；2×EsTaqMaster Mix、DNA Marker DL 2 000 plus 及血液/组织/细胞基因组提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；SPF鸡胚由杨凌绿方生物公司提供；其他试剂全部为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 流行病学、临床及病理剖检诊断 通过向养殖场饲养管理人员询问了解该病的发生情况，并观察流产母畜、流产胎儿及弱羔的临床症状。将流产胎儿和死胎带回实验室进行系统剖检检查，记录眼观病变。

1.2.2 血清学检测 对10份血清进行布鲁菌病虎红凝集试验，参考试剂盒说明书进行，主要程序为：被检血清和布鲁菌虎红抗原各0.03 mL滴于玻璃板上，并用干净的枪头混匀，在室温4 min～10 min内记录反应，并设置阴阳性血清对照，判定标准依据试剂盒说明书。

用衣原体间接血凝试验检测试剂盒对衣原体进行检测，参考试剂盒说明书进行。在血凝板上1～7排的第1～第10孔、第8排的第1～第4孔和第5～第7孔，加稀释液50 μL/孔；分别取待检流产母畜血清，标准阳性和标准阴性血清50 μL，依次加入反应板1～6排的第1孔，7排的第1孔和8排的第1孔中，与稀释液混匀后，吸取50 μL，加于第2孔中，作2倍稀释至第10孔，第10孔混匀后弃去50 μL。8排的阴性血清稀释到第4孔，混匀后从该孔弃去50 μL，第5～第7孔为稀释液对照，每孔只加入50 μL稀释液；阴、阳性血清和待检血清稀释孔和稀释液对照孔均加入25 μL的血凝抗原，将反应板在微型振荡器上震荡1 min～2 min，使血球分布均匀，封膜板封板，室温静置3 h～4 h判定结果。判定：当阳性对照血清完全凝集，阴性对照血清和稀释液对照都不凝集的情况下，试验成立。判断标准依据试剂盒说明书进行判断。

1.2.3 细菌分离培养 将采集的病料肺、脾、羊水和胎盘按照细菌分离鉴定的基本操作方法划线接种到鲜血琼脂平板上，分别置于有氧和无氧的环境中37℃，培养48 h，进行观察。

1.2.4 羊流产衣原体分离 将采集的流产胎儿的肺脏、脾脏和胎盘等内脏研碎后，用含适量青霉素(50 μg/mL)和链霉素(100 μg/mL )的PBS稀释，4℃放置3 h，再以3 000 r/min离心20 min，取上清，接种于5日龄～7日龄SPF鸡胚卵黄囊中。接种后3 d内死亡的SPF鸡胚丢弃，收集4 d～8 d死亡SPF鸡胚的卵黄囊膜，继续传代。同时无菌取少量的卵黄囊涂片待干燥后，经甲醇固定5 min，干燥后用吉姆萨氏染液染色30 min,用去离子水冲洗干燥后在光学显微镜下观察染色情况。假如第1次接种分离时，SPF鸡胚没有出现死亡再盲传3代～5代直至SPF鸡胚发生死亡。使用DNA提取试剂盒提取收集的SPF鸡胚的卵黄囊膜全基因组，按照参考文献[4]方法进行PCR检测。

1.2.5 PCR检测 为了进一步确定流产是否为鹦鹉热亲衣原体所引起，以提取胎水和4 d～8 d死亡的鸡胚的卵黄囊膜为材料按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。根据GenBank登录的流产衣原体的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0设计一段引物，进行PCR扩增。引物序列：上游引物5′- CCCCAAGCCAGCATCTAATA-3′；下游引物5′- TTAGAGCCCAGGCAGTCTCG-3′。按照参考文献[5-6]介绍方法进行PCR扩增。95℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃再延伸10 min。PCR 20 μL反应体系：10 μL 2×EsTaqMasterMix，ddH2O 6 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板3 μL。PCR产物经过15 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，观察目的片段大小

2 结果

2.1 流行病学调查

怀孕母羊流产前4 d～8 d精神沉郁，但食欲正常，流产后逐渐恢复正常，当时没有引起养殖户足够的重视，但自2017年1月～3月间，所饲养的27只怀孕母羊中有10只发生流产，5只产出死羔，3只产出弱羔。流产前期怀孕母羊除了体温普遍升高至41℃～42℃外，其他没有明显的变化，流产后多数孕羊胎衣滞留，阴道持续2 d～3 d排出暗红色的胎衣，并且表面覆盖一层胶冻样物质。经询问，该养殖户对口蹄疫、布鲁菌、小反刍兽疫及羊痘均按相关免疫程序进行过疫苗免疫接种。

2.2 临床症状

怀孕母羊体温升高1.5℃～2.5℃，持续1周，食欲减退，精神不安，阴道排出少量黏液性或脓性分泌物，并且有大多数妊娠母羊在怀孕中期和晚期发生流产，流产母畜胎膜血样水肿，子叶呈暗红色并坏死，流产的胎儿出现木乃伊、死胎和弱羔三种情况，流产胎儿水肿(图1)，腹水增多，气管黏膜由于淤血而形成血斑，产弱羔表现神经症状、关节炎或结膜炎，有3头妊娠母羊无任何症状而突然发生流产。流产后2 d～3 d排出分泌物，大部分流产母畜有胎衣滞留情况。且发生流产的羊群流产率达20%～30%，且在流产羊群中有2头公羊出现睾丸炎和附睾炎。

图1 流产胎儿

2.3 病理剖检变化

流产母畜胎衣增厚并呈现水肿，流产胎儿可见其皮下水肿，皮肤上布有淤血斑，皮肤和黏膜通常有斑点状出血。剖检发现，流产胎儿肝脏肿大呈红黄色，心内外膜有出血点，脾脏肿大，肾表面有出血点，结膜、咽喉、气管黏膜、舌和淋巴结上经常可见斑点状出血；腹腔和胸腔有黄色渗出物。淋巴组织由于相关淋巴液的滞留而肿大。

2.4 细菌分离结果

病料在鲜血琼脂平板上划线在有氧和无氧的环境中37℃，培养48 h，都没有菌落生长。

2.5 衣原体分离结果

病料接种在7日龄的SPF鸡胚上，连续传代3代～5代后，可使接种的鸡胚4 d～8 d出现有规律性死亡和典型的病变特征：胚体充血并出血，鸡胚的头、背部有出血点；卵黄囊膜变稀薄，尿囊液清亮，囊膜有出现水肿的症状。光学显微镜下观察发现存在有蓝色和暗紫色的包涵体。

2.6 血清学检测结果

10份血清经布鲁菌病虎红凝集试验检测均为阴性，排除布鲁菌病可能。使用衣原体间接血凝试验试剂盒对无菌采集流产母畜的血液10份进行检测，在阳性血清，阴性血清和稀释液对照组结果成立的情况下，待检10份流产母羊血清检测结果均为阳性。

2.6 PCR检测结果

通过对胎水和卵黄囊膜基因组进行PCR检测，均扩增出523 bp的目的条带(图2)。PCR产物测序，结果和鹦鹉热衣原体基因100%相同。

M.DNA标准DL 2 000 plus；1.阳性对照；2.胎水；3.卵黄囊膜；4.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000 plus；1.Positive control;2.Fetal water;3.Yolk-sac membrane;4.Negative control

图2 PCR扩增产物电泳图

Fig.2 Electrophoresis of PCR products

3 讨论

据报道近年来部分养羊场中发现衣原体引起的羊流产病，呈现散在的流行，其传播途径多样，即可通过流产胎儿、胎衣和羊水污染的饲料、饮水等经消化道传染易感动物和人，蜱或昆虫在本病传播中也起一定作用，也可通过交配和精液传播，并且此病只发生在怀孕的母畜，怀孕母畜不表现明显的临床症状，母羊妊娠的中期和晚期发生流产，流产的胎儿为木乃伊、死产和弱羔，流产后几天可排出分泌物，胎衣常滞留，关于该病没有准确的诊断方法，而且对牛羊亲衣原体和鹦鹉热亲衣原体的区分报道很少[7]，因此常出现误诊，错过治疗该病的最佳时期，给养殖户造成巨大的经济损失[8-9]。鹦鹉热亲衣原体的天然宿主是禽类和哺乳动物；牛羊亲衣原体主要感染牛、羊，检测该类病时要注意区分。

本次检测为了进一步区分流产性亲衣原体和鹦鹉热亲衣原体，在实验室诊断方面通过间接血凝实验和PCR检测SPF鸡胚分离病原并对结果进行测序，共同检测病原。PCR检测结果和血清学检测结果均为阳性，且该养殖专业户没有打过任何衣原体的疫苗，PCR测序结果显示与鹦鹉热亲衣原体基因100%相同，综合流行病学调查、病理变化观察、临床剖检、血清学与PCR诊断最终确诊引起该养殖场妊娠母畜流产的病原为鹦鹉热亲衣原体，本次检测结果帮助该养殖专业户确定了引起怀孕母畜发生流产的病原，为其治疗提供了依据，对其他怀孕母羊进行预防性注射红霉素，流产胎儿进行深埋防止污染。本次分离鉴定获得鹦鹉热亲衣原体为实验室后续进行衣原体的荧光定量检测方法建立与分子克隆奠定了基础。

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ApplicationofBI-2000ImageAnalysisSysteminRabbitswithHemorrhagicShock

CHEN Xue,AN Ying,SHEN Nan,XU Bo,ZHAO Li-jing

(ExperimentCenter,JilinMedicalUniversity,Jilin,Jilin,132013,China)

Experimental study of hemorrhagic shock in rabbits is an important part in the experiment of medical function.In the daily teaching process,the traditional classical experiment only observed the change of blood pressure during the experiment.To solve this problem,we introduced the BI-2000 image analysis system,and applied it in the 2014th teaching reforme of clinical medicine,so that students have a more profound understanding of the mechanism of the occurrence and development of shock,and have a more intuitive understanding of the characteristics of the changes of microcirculation blood perfusion in each stage of shock.

BI-2000 image analysis system; rabbit; hemorrhagic shock; experimental method

DiagnosisofChlamydophilaabortusInfectioninGoats

WU Hao-yang1,2,HUANG jia-li1,XU Ying1,SUN Pei2,FU Ming-zhe1,XU Xin-gang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,Chian; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui,230036,Chian)

S852.67

B

1007-5038(2017)12-0133-04

2017-04-27

陕西省农业科技创新与攻关项目(2016NY-092)；陕西省科技统筹创新工程计划项目(2016KTZDNY02-05)；杨凌示范区农业科技示范推广项目(TS-2016-13；2017-TS-23)

吴浩阳(1991-)，男，河南洛阳人，硕士，主要从事动物传染病诊断与防治研究。*

Abstract:The diagnoses of goat miscarriage in a certain goat farm in Shaanxi province were carried out by epidemiological investigation,clinical symptoms and pathological examination,brucellosis tiger red plate agglutination test,chlamydia indirect hemagglutination kit and PCR.The results showed that the chlamydia specific fragment was amplified by PCR from the genome ofChlamydophilaabortusin GenBank,the clinical symptoms and pathological lesions were initially suspected to be infected withBrucellaandChlamydiapsittaci.All the serological tests showed thatBrucellawas negative and theChlamydophilaabortuswas all positive.The PCR results obtained 523 bp gene fragment,sequencing results showed 100% similarity withChlamydiapsittaci.According to epidemiological investigation,clinical symptoms and pathologic examination,etiology and serological diagnosis and PCR,the final diagnosis of the disease was made as native epidemic goat abortion caused byChlamydiapsittaci.

Keywords:goat abortion;Chlamydiapsittaci; diagnosis