腹泻羔羊与健康羔羊肠道微生物群落分析

罗海霞，杨 易，谢秀兰

(1.宁夏大学生命科学学院 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏银川 750021;2.宁夏农林科学院动物科学研究所,宁夏银川 750002)

腹泻羔羊与健康羔羊肠道微生物群落分析

罗海霞1，杨 易1，谢秀兰*

(1.宁夏大学生命科学学院 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏银川 750021;2.宁夏农林科学院动物科学研究所,宁夏银川 750002)

羔羊腹泻与其肠道菌群的种类及比例密切关系。为了探索肠道菌群结构在腹泻病程的变化，采集同样饲养条件下20份1月龄～3月龄滩寒杂交羊粪便样本，通过Miseq测序技术并结合多变量统计学方法检测细菌16S rRNA基因V4-V5区的多样性，通过数据分析，比较了腹泻羊粪便与正常羊粪便中微生物的类别及数量。从门的水平分析，腹泻羔羊肠道中变形菌门显著高于健康羔羊。发现拟杆菌门、蓝细菌门、黏胶球形菌门和无壁细菌门在腹泻羔羊中的含量显著低于健康羔羊。从科水平分析2个样本优势菌具有显著差异，其中腹泻羔羊肠道放线菌乳杆菌科显著高于健康羔羊，而瘤胃球菌科显著低于健康羔羊。非优势菌也存在显著差异，如拟杆菌科、柔膜菌科和理研菌科。比较了滩寒杂交羊健康羔羊及腹泻羔羊肠道微生物的差异，发现其微生物丰度及优势微生物都具有显著的差异，因此，腹泻羔羊中的肠道微生物差异可能是羔羊腹泻的重要因素之一，研究结果为羔羊腹泻的研究及治疗提供了理论依据。

滩寒杂交羊；羔羊；肠道微生物；腹泻

动物的肠道菌群具有营养与代谢，免疫与保护，维持肠道菌群平衡，改善肠道环境，促进动物生长发育等作用[1]。肠道菌群的研究已成为全球研究热点。肠道微生物菌群结构并非一成不变，而是与宿主的年龄、居住环境、食物、健康状态等元素密切相关[2]。3月龄以内为羔羊期，1月龄～3月龄羔羊腹泻病是规模养羊场多发病，发病率在60%左右，病死率达49.8%，临床表现为腹泻、肠炎、腹痛、脱水等，给养羊业带来严重损失[3]。诱发羔羊腹泻的主要病因是致病菌的感染，比如大肠埃希菌、沙门菌、肠球菌等[4]。但对羔羊肠道微生物分布报道较少，尤其对健康羔羊及腹泻羔羊肠道菌的差异报道较少。随着测序技术的发展，采用16S rRNA 高通量测序的方法研究肠道微生物菌落，可以对肠道微生物中的所有菌种进行精确定量，该方法已经成为研究肠道微生物丰度变化的主流。

滩寒杂交羊有良好的生长和发育性能，具有出栏周期短、体型大、肉质鲜嫩等有点，被广泛饲养[5]。本研究采集20只1月龄～3月龄滩寒杂交羔羊粪便，其中10只无腹泻症状的健康羔羊，10只具有明显腹泻症状羔羊。提取粪便样品DNA，PCR 扩增16S rRNA V4-V5区，Miseq测序，通过数据比对方法分析健康羔羊与腹泻羔羊肠道菌群落的结构及多样性。本研究比较健康羔羊及腹泻羔羊肠道微生物菌群，为患病羔羊能够得到及时治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所采集的羔羊来自同一羊场3月龄以内3.5 kg～20 kg滩寒杂交羊。采取舍饲管理，羔羊饲养采取哺乳和混合日粮饲养(混合日粮饲料：玉米82%,豆饼15%,石灰石矿石粉1.4%,盐0.5%,添加剂0.1%，苜蓿干草，可占饲料总量的30%～60%。)，粗料自由采食。所采集的羔羊从未使用任何抗生素类药物。DNA 提取试剂盒购自Mobio 公司;DNA凝胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 健康羔羊粪便样品采集通过尾部固定灭菌试管收集2粒～3粒粪便样品，腹泻羔羊粪便样品通过肛门蘸取2个灭菌医用棉签的粪便样品。样品存于-80℃冰箱备用。

1.2.2 样品总DNA提取 所有粪便样品均采用DNA 提取试剂盒提取样品的总基因组DNA，具体的操作严格按试剂盒说明书进行。用DNA纯化试剂盒纯化以及用20 g/L琼脂糖凝胶电泳性检测和Nano drop测定浓度，置-20℃保存。

1.2.3 16S rRNA基因扩增 对所提取的DNA样品PCR扩增16S rRNA V4-V5区，选用上游引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和下游引物907R (5′- CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。扩增体系为20 μL体系，采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase，模板为10 ng。扩增条件:95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s；72℃ 45 s，27个循环；72℃ 10 min。切胶回收PCR产物，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)，Tris-HCl洗脱，20 g/L琼脂糖凝胶电泳性检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行定量检测，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。将总PCR产物经Illumina MiSeq2000 测序仪进行PE100-bp 测序(上海凌恩)。

1.2.4 数据分析 使用Trimmomatic和FLASH软件，将Miseq测序得到的是双端序列数据进行过滤和拼接。过滤read尾部质量值20 bp以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的reads；根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接成一条序列，最小overlap长度为10 bp；拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。

原始数据通过优化，统计平均序列长度在394 bp左右的。首先，对优化序列提取非重复序列(http://drive5.com/usearch/manual/dereplication.html)，以便于降低分析中间过程冗余计算量。其次，去除没有重复的单序列(http://drive5.com/usearch/manual/singletons.html)；按照RDP classifier贝叶斯算法对97%相似性非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类(Usearch，vsesion 7.1 http://drive5.com/uparse/)，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。

2 结果

2.1 数据统计及Specaccum物种累积曲线

扩增提取DNA 16S rRNA V4-V5 区，扩增的PCR产物条带大小正确，浓度合适。MiSeq 2 000

测序16 S rRNA并数据优化。各个样本的数据统计，扩增获得749 183条16 S rRNA序列，总长度为295 823 540 bp，每条序列的平均长度为394.86 bp。物种累积曲线是用于描述随着样本量的加大物种增加的状况(图1)，当曲线表现趋于平缓，表明抽样相对充分，能够反应腹泻与健康羔羊中的微生物数量及分布。

图1 测序的样本数

2.2 肠道菌群的门水平分布

通过同源性序列比对及聚类相结合的方法，将所有的序列鉴定为15个门，相对丰度大于1%进行比较(图2)，其中拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门 (Spirochaetae)和无壁细菌门(Tenercutes)8个细菌门的相对分度占到了测序的94.3%。变形菌门(Proteobacteria)在腹泻羔羊中的相对丰度显著高于健康羔羊(腹泻羔羊/健康羔羊平均值为14.98% vs 1.63%，P<0.05)，特别是7号腹泻羔羊中变形菌门相对丰度占56.66%。拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌(Cyanobacteria)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)和无壁细菌门(Tenercutes)在腹泻羔羊中的相对丰度显著低于健康羔羊，分别为拟杆菌门(12.22% vs 25.66%，P<0.05)、蓝细菌门(0.075% vs 0.53%，P<0.05)、 黏胶球形菌门(0.001% vs 0.035%，P<0.05)、无壁细菌门(0.35%,5.32%)。腹泻羔羊和健康羔羊肠道中厚壁菌门(Firmicutes)为优势菌门，无显著差异(腹泻羔羊/健康羔羊平均相对丰度为70.50%，53.12%，P>0.05)。

左边柱状图为腹泻样品(F1～F10),健康样品(1～10)；右边柱状图F-average为腹泻羔羊菌落相对丰度的平均值，N-average为健康羔羊菌落相对丰度的平均值

Histogram on the left presents samples from diarrhea (F1-F10) and health lambs(1-10); "F-average" on the right histogram stands for the average microbial abundance among 10 diarrhea lambs,"N-average" stands for the average microbial abundance among 10 health lambs

图2肠道菌群门水平分布图

Fig.2 Intestinal microbial distribution in phylum level

2.3 肠道菌群的科水平分布

科水平相对丰度大于10%的优势菌为拟杆菌科(Bacteroidaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、放线菌乳杆菌科(Lactobacillaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)，其中放线菌乳杆菌科和瘤胃球菌科差异显著(P<0.05)。放线菌乳杆菌科腹泻羔羊/健康羔羊相对丰度为23.5% vs 0.07%(P<0.05)，瘤胃球菌科在腹泻羔羊中的相对丰度显著低于健康羔羊肠道微生物的比例14.1% vs 40.82%(P<0.05)。然而，拟杆菌科和毛螺科菌相对丰度无显著差异P>0.05。非优势菌(百分比小于10%)在腹泻羔羊中的相对丰度显著低于健康羔羊(P<0.05)。Bacteroidales、Christensenellaceae、Mollicutes和Rikenellaceae在腹泻羔羊中的相对丰度分别为1%、0.39%、0.32%、0.41%、1.36%，在健康羔羊中的相对丰度分别为6.83%、2.14%、4.63%、1.91%、9.49%(图3)。

4 讨论

肠道菌群主要分为肠腔内菌群和肠道黏膜相关菌群两大类。肠腔内菌群即粪便菌群，其黏附于食物残渣或混合于粪便中，主要由好氧菌和兼性好氧菌组成[6]。肠道环境中80%～99%的微生物是不可培养的，通过高通量测序技术可以定性的测定微生物的形态特征和丰度，而且能够分析它们的空间分布、揭示并观察微生物的多样性[7]。3月龄以下为高洋期，羔羊腹泻病是规模养羊场常见多发病，但羔羊肠道菌落微生物，特别是腹泻羔羊的肠道微生物报道较少，本论文就健康羔羊及腹泻羔羊肠道微生物菌落进行分析，以比较肠道微生物与羔羊腹泻之间的关系。

总体看来，在所有检测羔羊中厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌，腹泻羔羊肠道厚壁菌门高于健康羔羊，但差异不显著(腹泻羔羊/健康羔羊平均值为70.50%，53.12%，P>0.05)。而拟杆菌门在肠道菌落的分布中低于健康羔羊并且差异显著(腹泻羔羊/健康羔羊平均值为12.22% vs 25.66%，P<0.05)该报道与在人肠道微生物的研究结果相一致[8]。研究发现在人的肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门共占到人类远端肠道菌群的90%以上。文献报道，这两组菌门在人体物质代谢过程中发挥重要作用。拟杆菌门参与碳水化合物的代谢过程，厚壁菌门参与能量的吸收过程，而当菌群失调，厚壁菌门增加而拟杆菌门减少时会增加发病概率。本研究中腹泻羔羊中厚壁菌门高于健康羔羊，而拟杆菌门显著低于健康羔羊，因此，该两个菌门的相对丰度的差异可能与导致羔羊腹泻原因之一。变形菌门是细菌中最大的一门，包括很多病原菌，如大肠埃希菌、沙门菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌等。本研究发现腹泻羔羊变形菌门明显高于健康羔羊(6.3倍)。Shin N R等[9]通过对人肠道微生物菌群的研究中发现健康人体肠道中变形菌门丰度较低，少量的变形菌门与宿主和平共存，而在一些致病因素的作用下会诱发其大量增殖，产生促炎因子，引发肠道炎症发现腹泻患者。Durban A等[10]通过进一步研究变形菌门可能参与急性腹泻的发生。以上结果与本研究相符，说明腹泻羔羊肠道变形菌门高于健康羔羊可能是导致腹泻发生的病因之一。

左边柱状图为腹泻样品(F1-F10),健康样品(1-10)；右边柱状图“F-average”为腹泻羔羊菌落相对丰度的平均值，“N-average”为健康羔羊菌落相对丰度的平均值

Histogram on the left presents samples from diarrhea (F1-F10) and health lambs(1-10); "F-average" on the right histogram stands for the average microbial abundance among 10 diarrhea lambs,"N-average" stands for the average microbial abundance among 10 health lambs

图3肠道菌群科水平分布图

Fig.3 Intestinal microbial distribution in family level

通过检索，尚未发现关于放线菌乳杆菌科与动物腹泻方面的相关报道。放线菌乳杆菌科一般为非致病菌，如乳酸菌有助于治疗某些肠道微生物紊乱的疾病。而本研究结果显示放线菌乳杆菌科在腹泻羔羊中的相对丰度显著高于健康羔羊，在F10羔羊中高达90%。需要进一步对健康羔羊代谢产物等生理机能进行研究，说明放线菌乳杆菌科与羔羊腹泻的相互关系。瘤胃球菌科是具有差异的优势菌，在腹泻羔羊中的相对丰度著低于健康羔羊(14.1% vs 40.82%，P<0.05。)胃球菌科属于革兰阳性厌氧细菌。存在反刍动物瘤胃等处[11]。瘤胃、网胃和瓣胃是反刍动物前胃。瘤胃微生物在反刍动物的饲料消化过程中起着重要的作用，它们每天消化的量占采食总碳水化合物的50%～55%[12]。健康羔羊中的胃球菌科高于腹泻羔羊，可能相对腹泻羔羊，健康羔羊已建力了较为完善的肠道微生物系。羔羊的肠道健康与的肠道微生物多样性及分布相关。腹泻羔羊与健康羔羊的微生物存在显著差异。本研究比较了3月龄以内健康羔羊和腹泻羔羊粪便微生物菌落，分析了的肠道的差异，为研究肠道微生物与羔羊腹泻防治提供了理论依据。

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AnalysisofIntestinalMicrobialDiversityinDiarrheaandHealthyLambs

LUO Hai-xia1，YANG Yi1,XIE Xiu-lan2

(1.KeyLaboratoryofMinistryofEducationforConservationandUtilizationofSpecialBiologicalResourcesintheWesternChina,LifeScienceSchool,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750021,China; 2.InstituteofAnimalScience,NingxiaAgricultureandForestrySciencesAcademy,Yinchuan,Ningxia,750002,China)

The lamb diarrhea is highly related to the type and proportion of intestinal flora.In order to investigate the changes of intestinal flora during the diarrhea,fecal samples were collected from three-month old sheep under the same feeding condition.The fecal bacteria 16S rRNA V4-V5 regions were detected by Miseq sequencing technology with combining multivariate statistical methods to evaluate the diversity of microbial community.The types and quantities of microorganisms in diarrhea lambs and health lambs were compared by using data analysis.The analysis result demonstrated that Proteobacteria from lambs with diarrhea is significantly higher than that from healthy lambs in the phylum level while Bacteroidetes,Cyanobacteria,Lentisphaerae and Tenercutes in lambs with diarrhea are significantly lower than that from healthy lambs.Dominant bacteria are significantly different in family level.Lactobacillaceae in the intestinal tract of lambs with diarrhea is significantly higher than that from healthy ones.Ruminococcaceae is significantly lower in the health lambs.Non dominant bacteria also demonstrated significant difference,such as Bacteroidales,Mollicutes and Rikenellaceae.The data obtained from this experiment have a certain guidance to understand the composition of the intestinal microflora and provide a practical guidance for treating diarrhea disease effectively.

Tanhan hybrid sheep; lamb; intestinal microorganism; diarrhea

2017-04-11

宁夏自治区留学人员创新创业择优资助项目(宁人社函2014第486号)；宁夏大学人才引进科研启动基金;宁夏自然科学基金项目(NZ14017);宁夏农林科学院先导基金项目(NKYJ-14-10)

罗海霞(1981-)，女，宁夏海原人，博士，主要从事病原微生物研究。*

S852.6

A

1007-5038(2017)12-0086-05