非洲马瘟病毒RT-LAMP检测方法的建立

姜睿姣，邬旭龙，张鹏飞，王 印,2*，杨泽晓,2，姚学萍,2

(1.四川农业大学动物医学院，四川成都 611130；2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川成都 611130)

研究论文

非洲马瘟病毒RT-LAMP检测方法的建立

姜睿姣1，邬旭龙1，张鹏飞1，王 印1,2*，杨泽晓1,2，姚学萍1,2

(1.四川农业大学动物医学院，四川成都 611130；2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川成都 611130)

为了建立非洲马瘟病毒(AHSV)环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)快速检测方法，基于AHSV VP7基因保守序列，设计2对特异性扩增引物。通过对反应体系中各组分浓度，反应温度及时间的优化，建立了快速、灵敏的AHSV RT-LAMP检测方法，并对该方法特异性、灵敏度、重复性进行探索。结果表明，在63℃恒温下反应45 min，便可进行高效率的特异性扩增。反应产物经琼脂糖凝胶电泳和染料可视化鉴定，能够快速有效检测AHSV。用建立的方法检测马属动物易感的4种疫病病原，结果均为阴性，证实具有较高的特异性。灵敏度是RT-PCR的1 000倍。建立了AHSV RT-LAMP检测方法，具有快速、特异、灵敏、操作简单、设备要求低的特点，适合用于现场AHSV快速检测。

非洲马瘟病毒；环介导等温扩增；检测

非洲马瘟(African horse sickness,AHS)是由非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)引起马属动物的一种急性或亚急性的虫媒传染病[1-2]。其主要病理特征有发热、皮下组织水肿、肺水肿、脏器出血等。所有马属动物中，马对此病最易感，病死率可高达90%。AHS被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。AHS主要流行于非洲撒哈拉沙漠以南地区，在欧洲、中东的部分国家和地区偶有发生[3]。

AHSV属呼肠病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbiviru)，现已知有9种血清型，不同型病毒的毒力强弱不相同，各型之间具有交互免疫关系，如5型与8型、6型与9型[3-4]。该病毒无囊膜，直径约75 nm，基因组由10个大小不等的双链RNA片段构成，共编码7种结构蛋白(VP1-7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3A)。其中VP7在ASHV各血清中高度保守，是该病毒的血清群特异性抗原[5]。

日本学者Notomi T等[6]发明了环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。目前，RT-LAMP技术也广泛用于RNA病毒的检测，如SARS冠状病毒、口蹄疫病毒[7-11]。与传统PCR相比，该技术通常可在15min～60min内实现109倍～1010倍的扩增，白色产物焦磷酸酶沉淀可通过肉眼观察到，除此以外，还能用荧光染色剂SYBR Green I染色观察。LAMP不需要复杂的仪器设备，仅依靠2对～3对特异引物和一种链置换 DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)，在恒温下短时间内便能高效、快捷、特异扩增靶序列。目前，LAMP方法已经广泛应用于病原体的检测，如猪细小病毒[12]。本研究建立了一种检测非洲马瘟病毒的RT-LAMP方法。

目前中国虽无非洲马瘟的发生，但随着各国贸易往来变频繁、气候改变，加之此病通过蚊虫传播，并不能完全保证AHS不会传入进中国。因此，建立一种快速、灵敏、特异的检测方法，有助于现场立即检测出本病或排除本病，尽可能减小损失。

1 材料与方法

1.1 材料

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、链球菌(Streptococcus)、狂犬病病毒(Rabies virus,RV)由四川农业大学动物检疫实验室提供。利用DNA/RNA提取试剂盒提取病毒DNA/RNA，RNA反转录为cDNA，置-80℃保存备用。

1.2 主要试剂

Bst DNA聚合酶、Mg2+购于New England Biolabs(NEB)；dNTP、2×TaqPCR Master Mix、RNA反转录试剂盒、DNA Marker DL 2 000购于宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒、DNA/RNA提取试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯产品。

1.3 方法

1.3.1 DNA的制备 在NCBI中获取AHSV VP7基因序列(GenBank：KT030566.1)，通过DNAStar软件比对分析，人工合成AHSV VP7保守基因序列。将载有目的基因质粒的菌株纯培养后，利用质粒提取试剂盒提取目的基因质粒作为模板，送至华大公司测序鉴定后，置-80℃保存备用。

1.3.2 引物设计 根据GenBank公布的AHSV VP7保守基因序列，利用在线软件 Primer Explorer V5，设计并筛选出2对引物(包括2条外引物F3、B3，2条内引物FIP、BIP)。引物序列见表1，由擎科生物公司合成。

表1 引物序列

1.3.3 AHSV RT-LAMP反应优化 AHSV RT-LAMP的反应体系为25 μL，依次对dNTP浓度、Mg2+浓度、甜菜碱浓度、引物浓度及温度进行优化。具体梯度如下：dNTP终浓度为0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L；Mg2+终浓度分别为2、4、6、8、10 mmol/L；甜菜碱终浓度分别为0、0.5、1、1.5、2 mol/L；内引物终浓度分别为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 μmol/L；外引物终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μmol/L，10×Bst buffer 2.5 μL，Bst DNA 聚合酶8 U，模板2 μL，反应温度优化分别为61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，反应时间优化分别为30、45、60、75、90 min。所有体系恒温反应后，80℃加热 2 min终止反应。取5 μL反应产物于20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，以确定最佳的反应体系。添加 SYBR Green Ⅰ染料，并在紫外灯下观察。

1.3.4 RT-LAMP产物酶切鉴定 用Primer Premier 5软件分析目的片段的酶切位点，并筛选出具有单一位点的酶EcoRV，预计酶切产物为163 bp和65 bp。20 μL反应体系中含EcoRV 10 U，RT-LAMP 产物5 μL，10×缓冲液2 μL，37℃反应4 h，取8 μL的酶切产物在20 g/L琼脂糖凝胶中电泳鉴定。

1.3.5 RT-PCR检测 利用外引物F3、B3进行AHSV RT-PCR扩增，反应体系为25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，F3、B3各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。按如下程序进行：94℃ 3 min；94℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s共34个循环；72℃ 5 min。取5 μL反应产物于20 g/L琼脂糖凝胶电泳后，将产物送至华大基因测序鉴定。

1.3.6 RT-LAMP灵敏度检测 利用Nano Drop 2 000核酸蛋白分析仪对AHSV重组质粒进行定量测定，根据核酸浓度计算质粒拷贝数[13]。将AHSV重组质粒进行10倍梯度稀释，利用的AHSV RT-LAMP和RT-PCR检测方法，分别对1×106copies/μL～1 copies/μL的DNA进行试验，对比两者检测灵敏度。

1.4 RT-LAMP特异性和重复性试验

根据建立的AHSV RT-LAMP检测方法，分别对AHSV、EIAV、JEV、Streptococcus、RV进行特异性试验。扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。以AHSV阳性质粒为模板，3次不同时间进行反应，同时设立3次重复，对建立的RT-LAMP检测方法进行重复性探索及检测。

2 结果

2.1 AHSV RT-LAMP方法的建立

经过对AHSV RT-LAMP反应体系和条件的优化，最终反应体系为25 μL：外引物F3、B3各0.2 μmol/L；内引物FIP、BIP各1.6 μmol/L；Mg2+6 mmol/L；甜菜碱1 mol/L；dNTP混合液1.2 mmol/L；10×Bst buffer 2.5 μL；Bst DNA 聚合酶8 U；模板2 μL；ddH2O补足25 μL。反应在63℃恒温反应45 min后，80℃灭活2 min。产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，可见清晰的阶梯状条带。在体系反应结束后添加 SYBR Green Ⅰ荧光染料，在紫外灯照下，阴性反应管呈橘红色，而阳性反应管散发绿色荧光，介于两者之间的反应管有黄绿色荧光(图1)。

2.2 RT-LAMP特异性试验

以AHSV质粒作为阳性对照，检测马传染性贫血病病毒、日本脑炎病毒、链球菌、狂犬病病毒进行特异性试验，验证所建立RT-LAMP方法的特异性。结果表明，只有AHSV呈阳性，其他试验样品呈阴性(图2)。

2.3 RT-LAMP灵敏度检测

将AHSV重组质粒进行10倍梯度稀释，分别对1×106copies/μL～1 copies/μL的DNA进行灵敏度检测，对比两者检测灵敏度。结果表明，用传统RT-PCR的检测极限为1×104copies/μL，而用RT-LAMP检测方法检测量为1×101copies/μL，RT-LAMP的灵敏度为传统RT-PCR的1 000倍，RT-PCR目的扩增条带为228 bp(图3)。

1.空白对照；2.未优化的反应体系；3.最优反应体系

1.Blank control; 2.Not optimized reaction system; 3.The optimal reaction system

图1 SYBR GreenⅠ染色结果

Fig.1 Coloration results of SYBR GreenⅠ

2.4 RT-LAMP产物酶切鉴定

RT-LAMP反应产物经EcoRV酶切后，取5 μL反应产物上样于20 g/L琼脂糖凝胶电泳(图4)，可以看到一条163 bp和65 bp的条带，与理论值相符，说明RT-LAMP 扩增的条带是AHSV的VP7基因。以F3、B3为外引物，LAMP扩增产物为模板，进行PCR反应，产物测序鉴定后，在NCBI BLAST进行比对，证实扩增序列为AHSV特异性序列。

M.DNA标准DL 2 000；1～5.依次为AHSV、EIAV、JEV、Streptococus、RV样本；6.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-5.Simples of AHSV,EIAV,JEV,Stretococus,RV respectively; 6.Blank control

图2 RT-LAMP特异性检测

Fig.2 Specificity test for RT-LAMP

M.DNA标准DL 2 000；1～6.样品依次为106、105、104、103、102、101copies/μL；8～13.样品依次为106、105、104、103、102、101copies/μL；7、14.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-7.106,105,104,103,102,101copies/μL samples,respectively; 8-13.106,105,104,103,102,101copies/μL samples,respectively; 7,14.Blank control

图3灵敏度检测

Fig.3 Sensitivity test

M.DNA 标准 DL 2 000; 1.RT-LAMP酶切产物

M.DNA Marker DL 2 000; 1.RT-LAMP products digested withEcoRV

图4 RT-LAMP产物酶切鉴定

Fig.4 Determination of RT-LAMP products digested withEcoRV

3 讨论

AHS作为一种高致病性的虫媒传染病，能引起马属动物皮下组织水肿、肺水肿、内脏出血等症状。由于AHS发病迅速，病死率极高，我国将其列为一类动物疫病。各国贸易往来越发频繁、进出口马匹越多，此病的传播就会越发迅速。因此，中国现在虽未发生本病，但建立一种高效、迅速检测方法的储备，有利于及时检测此病病原，将该病拒亡国门之外。

RT-LAMP是一种新型的核酸等温扩增方法，此方法相比较于RT-PCR有诸多优点。首先，RT-LAMP的扩增效率极高，在短短的15min～60 min内，就能将目的片段扩增109～1010倍，极大程度节省了检测的时间，对于现场及时检测具有重大的意义。其次，RT-LAMP检测方法的灵敏度高，特异性强。就本研究而言，RT-LAMP的灵敏度是传统RT-PCR的1 000倍；1对外引物和1对内引物保证了扩增时的高特异性。使得检测的结果更加清晰、准确。再者，结果的检测简单，可通过肉眼观察是否有白色的焦磷酸镁产生，亦或加入SYBR Green I染料观察是否有荧光绿，便判断是否有产物生成，且全程无需复杂的设备。因而，此技术已用于人、动物、植物的多种病原体检测检测，具有很高的实用价值。由于RT-LAMP的灵敏度极高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，加之实验室并无严格分区，假阳性的情况发生较频繁。所以在操作时应谨慎，切忌把反应后的反应管打开。

本研究发现，针对本套引物，在整个反应体系内Mg2+浓度为6 mmol/L反应条带最佳，与大多文献报道最佳Mg2+浓度为8 mmol/L不一致[7,12-13]。内、外引物浓度比值比引物的绝对浓度更重要，本研究浓度比值为8∶1时，扩增的效率最高。这与以往文献报道的一般选取4∶1或8∶1的内、外引物比值有高扩增效率一致。一般情况下，RT-LAMP在15 min～60 min之内、61℃～65℃之间能观察到明显的条带。本研究在45 min之后才能观察到条带，反应温度以63℃最佳。由此可见，对于不同的引物和模板，反应体系各组分的最佳浓度、反应最短时间以及最适温度也会随之改变。因此，优化一个反应体系，对于建立某种病毒最理想的检测方法是必不可少的。

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2017-03-28

“十二五”国家科技支撑计划项目(2013BADl2804)

姜睿姣(1996-)，女，四川雅安人，本科生，主要从事动物传染病病原微生物及其分子生物学研究。*

S852.65

A

1007-5038(2017)12-0001-05