棚室茄子不同栽培方式对土壤微生物多样性的影响

孟令波，刘彤彤，张春怡，李淑敏*，高 宇，黄沛荣

棚室茄子不同栽培方式对土壤微生物多样性的影响

孟令波1，刘彤彤2，张春怡2，李淑敏2*，高 宇2，黄沛荣2

（1.哈尔滨学院食品工程学院，哈尔滨 150086；2.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）

棚室茄子栽培易出现连作障碍，致使土传病害严重，产量下降。试验选取芥菜、油菜两种十字花科作物与茄子轮作，旨在探讨轮作模式对棚室茄子栽培连作土壤微生物多样性及群落结构影响。通过MiSeq测序分析表明，茄子/油菜轮作处理土壤细菌丰度、茄子/芥菜轮作处理土壤细菌多样性显著高于连作处理。聚类分析表明，茄子/油菜轮作和茄子/芥菜轮作土壤细菌群落结构与茄子连作和农药熏蒸处理不同，两个轮作处理土壤中Flavobacteria等细菌为优势种，可改善根区土壤生态条件，促进作物生长。真菌多样性分析表明，两个轮作处理土壤中真菌多样性和丰度显著降低，Chaetomium等腐生真菌数量增多，有利于提高土壤有机质含量，改善连作土壤质量，研究可为缓解棚室茄子连作障碍提供新思路。

轮作；十字花科作物；茄子；土壤微生物

茄子（Solanaceae melongena L.）是常见蔬菜作物，设施栽培中连作障碍严重[1]，导致土壤盐渍化程度提高，土传病害加剧，产量和品质下降。土壤微生物组成和群落结构是衡量土壤肥力重要指标，病原菌难以在微生物多样性高的土壤中生长、繁殖[2]。单一作物长期种植，土壤生物多样性降低，有害微生物增加，土壤微生物群落结构较差，造成连作障碍[3]。生产中常用农药熏蒸土壤防治土传病害，但破坏土壤微生物生态环境，易带来农药残留问题。寻找环境友好、防控土传病害方法是设施蔬菜生产中亟需解决问题。

轮作是缓解连作障碍有效途径之一，采取适当轮作方式，可有效改善壤质量，控制土传病害发生[4]。Brown等研究表明，十字花科作物混入连作土壤，可增加土壤细菌多样性，抑制有害菌生长、繁殖[5-6]。Radicetti等将十字花科芸苔属植物组织残渣施入小麦田，发现可减少土壤内小麦全蚀病菌（Gaeu-mannomyces graminsis）数量[7]。Piccinini等试验发现，芥菜、油菜等十字花科作物含有硫代葡萄糖苷，其降解产物异硫氰酸酯可杀死土壤中致病微生物，防控土传病害[8]。此外，已从十字花科作物根际分离出农杆菌（Agrobacterium）、芽孢杆菌（Bacillus）等有益菌株，可抑制土壤致病菌生长繁殖，促进植物生长[9]。研究结果表明，芥菜、油菜等十字花科蔬菜可作为轮作作物，克服连作障碍。

黑龙江省作物生长季节短，轮作模式防控茄子连作障碍鲜见报道。十字花科芸苔属蔬菜中芥菜和油菜在北方秋季种植，生物量大且生长期短，采收期为40 d左右，易与茄子轮作。芥菜与连作茄子轮作可显著控制茄子黄萎病发病率，提高产量[10]，但轮作后对土壤微生物群落结构和多样性影响尚不清楚。本试验选择茄子与以上两种作物轮作，研究轮作后与茄子连作土壤，比较土壤微生物多样性和群落结构变化，为揭示轮作缓解茄子连作障碍机理，有效防控土传病害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试作物

供试茄子品种为“龙杂9号”茄子（Solanaceae melongena L.LongZa-9），由黑龙江省农科院园艺分院茄子课题组提供；轮作十字花科作物为小花英芥菜（Brassica napiformis var.XiaoHua ying）、沃冠2号油菜（Brassica campestris L.WoGuan-2），种子购自黑龙江省农科院园艺分院种子店；供试农药为50%多菌灵可湿性粉剂（2-benzo imidazole methyl carbamate）购自江苏蓝丰生物化工有限公司。

1.1.2 试验地点及供试土壤基础肥力

试验地点为黑龙江省农业科学院园艺分院茄子课题组连作茄子12年大棚，土壤为黑钙土。按照鲍士旦方法测定土壤基础肥力[11]，分别为pH 6.95，有机质20.31 g·kg-1，全氮1.41 g·kg-1，速效磷 127.3 mg·kg-1，速效钾 190.1 mg·kg-1，硝态氮33.7 mg·kg-1。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

试验共设4个处理，每处理3次重复，连作茄子处理（CN）、茄子-芥菜轮作处理（BFN）、茄子-油菜轮作处理（BFC）、化学农药处理（CF）。每小区为5 m（宽）×10 m（长），两小区之间设置1 m间隔，以消除不同处理间影响。2015年8月18日种植芥菜和油菜，每个小区施氮150 kg·hm-2，钾100 kg·hm-2，硫 30 kg·hm-2，分别以尿素、K2SO4和（NH4）2SO4肥料施入。播种45 d（2015年10月16日）后，将剩余芥菜（BFN）和油菜（BFC）植株切碎混入土壤，旋耕机作业在20 cm土层深度内与土壤混合。CF处理区用50 g 50%多菌灵可湿性粉剂与土壤混匀，CN小区为连作茄子处理。各处理小区均灌水至75%田间持水量，用塑料膜覆盖15 d后（2015年10月31日）；揭掉塑料膜，充分散湿后，每个小区内，采用十字交叉法取0~20 cm耕层土壤样品，立即置于冰盒内，-80℃超低温冰箱保存，用于土壤微生物多样性测定。

1.2.2 土壤微生物多样性测定

1.2.2.1 土壤DNA提取及PCR扩增

用无菌镊子把每个土壤样品中植物根等杂物剔除，采用Fast DNA®Spin Kit for Soil（MP Bio medicals，U.S.A）试剂盒，提取每个样品土壤微生物DNA（提取方法参照制造商说明书），利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提DNA。检验合格后，将DNA提取物于-20℃条件储存，用于PCR扩增。

使用ABI GeneAmp®9700型PCR仪作PCR扩增。PCR采用Trans Gen AP221-02：TransStart Fast-Pfu DNA Polymerase，20 μL反应系统包括，4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，0.8 μL 正向引物（5 μmol·L-1），0.8 μL反向引物（5 μmol·L-1），0.4 μL FastPfu Polymerase，0.2 μLBSA，10.0 ng模板DNA，补ddH2O至20 μL。按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，对细菌16S rRNA V3-V4区域PCR扩增，引物为338F（5'-ACTCCT ACGGGAGGCAGCA-3'）与 806R（5'-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3'）；真菌引物为ITS1F（5'-CTTGG TCATTTAGAGGAAGTAA-3'）与 ITS2-2043R（5'-GCG CGTTCTTCATCGATGC-3'）。PCR反应参数：95 ℃3min后扩增循环30次，每循环95℃30s，55℃30s，72℃45 s，循环结束后于72℃5 min，10℃5 min结束反应。每个样本3个重复，将同一样本PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用Axy-PrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。

1.2.2.2 Illumina MiSeq测序

参照电泳初步定量结果，采用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）定量检测PCR产物，按照每个样本测序量要求混合。构建Illumina PE文库，根据标准方法使用Illumina MiSeq测序仪（美国/Illumina）对质检合格文库测序，并将原始读数存入NCBI序列阅读存档数据库，由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.2.2.3 测序数据生物信息分析

原始fastq文件，由QIIME（版本1.17）质量过滤。通过UPARSE（版本7.1 http://drive5.com/uparse/）软件生物信息统计分析获得操作分类单元（OTU），优化序列提取非重复序列，去除非重复单序列，按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）作OTU聚类，聚类过程去除嵌合体，得到OTU代表序列，将优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性97%以上序列，生成OTU表格。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平OTU代表序列作分类学分析，在各水平（domain，kingdom,phylum,class,order,family,genus,species）统计每个样品群落组成，16s细菌和细菌核糖体选择silva数据库，ITS真菌选择Unite真菌数据库，软件及算法为Qiime平台与RDP Classifier（http://sour ceforge.net/projects/rdpclassifier/），置信度阈值为0.7。利用Mothur软件（版本1.30.1）创建Rarefaction数据，分析微生物丰富度指数Chao和ACE，多样性指数Simpson和Shannon，指数评估的OTU相似水平为97%。

以SPSS统计软件（IBM SPSS Statistics 19）和Excel作数据处理与统计分析。差异显著性水平设为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增电泳检测

对4个处理12个样品PCR扩增后琼脂糖电泳检测发现，PCR产物目的条带正确，浓度合适，开展后续试验（见图1）。

2.2 土壤测序深度情况分析

测序4个处理12个土壤细菌样本，共检测到55129条序列片段，获得15 496个OTU，处理间差异不显著（见表1）；通过基因库比对发现，序列包括39门，92纲，201目，386科，741属，1 485种。对4个处理12个土壤真菌样本测序，共检测39 740条序列片段，获得1 524个OTU，连作茄子处理（CN）低于其他处理（见表1）；通过基因库比对发现，序列包括8门，25纲，65目，120科，248属，413种。

图1 PCR扩增电泳检测结果Fig.1 Electrophoretic detection results of PCR amplification

表1 茄子轮作和连作处理下根区土壤样本群落丰富度与多样性指数Table 1 Soil Community richness and diversity index of soil samples in eggplant rotation and continous eggplant planting treatments

对所测序列随机抽样，使用97%相似度OTU，利用mothur稀释性分析，R语言工具制作稀释性曲线（见图2）[12]，显示细菌和真菌稀释性曲线均趋向平坦，说明测序数据量合理，更多数据量仅产生少量新OTU。

2.3 土壤微生物丰度和多样性指数变化

Ace和Chao值是估计群落中OUT数目指数，可表示微生物群落丰度；Simpson和Shannon值是估算样本中微生物多样性指数，Shannon指数越大，表示物种多样性越小，个体分配越不均匀；Simpson指数则反之[13-14]。

通过表1可知，CF处理（化学农药处理）细菌Ace指数最小，说明农药消毒使土壤细菌丰度下降；BFN处理（茄子-芥菜轮作处理）Shannon指数最小，说明芥菜轮作后土壤细菌多样性水平上升，细菌种类分配均匀。真菌测定指数表明，Ace和Chao指数在4个处理之间无显著差异，说明不同处理土壤真菌丰富度无显著差异变化。CN（连作茄子处理）Shannon指数最小，Simpson指数最大，与其他三个处理比较均差异显著，说明连作土壤真菌种类最多，有益真菌菌种优势不明显；茄子-芥菜轮作处理（BFN）真菌Shannon指数显著低于化学农药（CF）和油菜轮作处理（BFC），Simpson指数高于CF和BFC处理，说明芥菜-茄子轮作对连作土壤部分种类真菌产生抑制作用，但相对农药处理保持一定土壤真菌多样性丰度。

图2 茄子轮作和连作处理下根区土壤样本细菌（Ⅰ）、真菌（Ⅱ）稀释性曲线图Fig.2 Bacterial(Ⅰ)and fungal(Ⅱ)rarefaction curves of eggplant rotation and continous cropping treatments

综上分析可知，芥菜轮作对连作土壤微生物有较大影响，芥菜残体混入土壤初期对一些种类真菌有抑制作用。同时，可保持真菌多样性丰度，提高土壤细菌多样性水平，使细菌种类分配更加均匀。

2.4 土壤微生物群落结构变化

2.4.1 细菌群落结构变化

由图3可知，处理土壤共有30个优势细菌，主要菌属包括：Flavobacterium（黄杆菌属）、Subgroup_6_norank、Anaerolineaceae_uncultured（厌氧绳菌属）、Arthrobacter（节杆菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）等。对不同处理细菌种类聚类分析发现，连作（CN）和农药处理（CF）土壤细菌群落结构相似，芥菜轮作处理（BFN）细菌群落结构与其他处理不同。在农药（CF）和连作处理（CN）中，Flavobacterium（黄杆菌属）相对丰度极低，分别占0.14%和0.08%；而在油菜轮作（BFC）和芥菜轮作处理（BFN）中，Flavobacterium（黄杆菌属）占5.04%和12.94%。芥菜轮作处理（BFN）黄杆菌属相对丰度是CN处理161.75倍。连作处理（CN）Anaerolineaceae_uncultured（厌氧蝇菌属）相对丰度值（3.44%）显著高于芥菜轮作处理（BFN）相对丰度值（1.29%），前者是后者2.67倍。Arthrobacter（节杆菌属）在CF处理中表现明显优势，其相对丰度值为3.74%；轮作处理（BFC、BFN）较CN处理相应增加。BFN和BFC处理Pseudomonas（假单胞菌属）相对丰度为5.99%和1.34%，与CN处理（0.41%）相比增加显著，增加比为5.58%与0.93%。

以上分析可知，在芥菜轮作处理（BFN）下，连作土壤细菌群落结构变化显著，土壤细菌多样性和有益细菌丰度的增加优于油菜轮作处理（BFN）与农药处理（CF）。

2.4.2 真菌群落结构变化

由图4可知，处理土壤中共有21种优势真菌菌属，主要包括：Mortierella（被孢霉属）、Chaetomium（毛壳菌属）、Chaetomiaceae_unclassified、Sordariomycetes_unclassified（粪壳菌属）、Cladosporium（枝孢霉属）、Alternaria（链格孢属）。CN与CF处理真菌群落被聚为一组，BFC与BFN处理真菌群落被聚为一组，说明轮作处理有相似土壤真菌群落结构。BFC、BFN、CF处理土壤Mortierella（被孢霉属）相对丰度值较低，尤其是CF处理（15.99%）比CN处理（39.94%）降低23.957%。Chaetomium（毛壳菌属）相对丰度BFC处理为11.72%，BFN处理为13.88%，显著低于CF处理（20.70%），在CN处理中该菌属消失；Chaetomiaceae_unclassified相对丰度值BFN处理为8.11%，显著低于CF处理（11.23%），但显著高于CN处理。Sordariomycetes_unclassified（粪壳菌属）BFN和BFC处理为优势菌群，相对丰度值为8.46%和8.07%，而CF处理仅为1.87%。

说明在连作处理下，连作土壤真菌群落结构发生变化，Mortierella（被孢霉属）等菌属相对丰度值下降，Sordariomycetes_unclassified（粪壳菌属）相对丰度值提高，芥菜轮作处理（BFN）提高幅度高于油菜轮作（BFC）。

图3 茄子连作和轮作处理土壤主要细菌种类（属）和相对丰度变化Fig.3 Relative read abundance of different bacterial community structures at the genus level in eggplant rotation and continous eggplant planting treatments

图4 茄子连作和轮作处理土壤主要真菌种类（属）和相对丰度变化Fig.4 Relative read abundance of different fungi community structures at the genus level in eggplant rotation and and continous eggplant planting treatments

3 讨论

土壤微生物组成和群落结构是衡量土壤质量重要指标[2]，长期种植单一作物，根际土壤微生态系统失调[15]、土壤养分失衡[16]、土壤微生物多样性降低、有害微生物增加、微生物群落结构改变[3]。轮作可有效调节土壤微生物区系，增加微生物群落多样性和稳定性，改善土壤微生态环境，减轻甚至克服作物连作障碍[17]。本试验通过MiSeq高通量测序技术测定不同轮作和茄子连作处理土壤细菌和真菌多样性，Illumina MiSeq测序整合引物，利用大量高质量序列数据表征多个微生物群落，可准确检测土壤微生物种类和群落结构变化。本试验研究表明，十字花科作物与茄子轮作并结合生物熏蒸可提高土壤细菌丰富度和多样性，改善连作土壤生态环境。小麦/玉米/大豆轮作[18]、黄瓜/大麦轮作[19]、滁菊/小麦轮作[20]等试验表明合理轮作模式可改善土壤微生物结构，与本文研究结果一致。

本试验结果表明，BFN处理细菌群落多样性最高，CN处理细菌多样性最低；而真菌多样性则相反，CN处理最高，BFN处理最低（见表1）。在大棚茄子栽培中，芥菜、油菜与茄子轮作处理（BFN和BFC处理）明显改变连作茄子土壤细菌丰富度和多样性，增加土壤细菌多样性，降低土壤中真菌多样性。Kintché研究指出，连作使土壤微生物种群比例失衡，由高肥“细菌型”向低肥“真菌型”转化，增加致病性真菌，病虫害加剧[3]。本试验中，茄子通过与2种十字花科蔬菜轮作改变土壤微生物多样性，降低真菌多样性，可缓解连作障碍。

本试验于12个样品中鉴定出30个优势细菌属（见图3）。4种处理中细菌属丰富度存在差异。例如，CF和CN处理中检测到Flavobacteria（黄杆菌属）丰度值较低，而BFC和BFN中却是优势菌，分别占5.04%和12.94%。在有机质含量高的土壤中Flavobacteria生长迅速。BFC和BFN处理可提高土壤有机质含量，轮作处理土壤Flavobacteria丰度显著高于CF和CN非轮作处理。应益昕发现，Actinomycetes和Pseudomonas等细菌种属在土壤中可抑制土传病原体繁殖，克服连作导致的土传病害和土壤酸化等弱化作用[21]。Pseudomonas（假单胞菌属）作为一种拮抗剂，可抑制许多植物病原体并促进植物生长[22]。BFN处理Pseudomonas丰度（5.99%）显著增高，比CN处理（0.41%）增加5.58%，BFC处理（1.34%）略增加0.97%。本试验结果表明，十字花科蔬菜与茄子轮作后，土壤有益细菌丰度增加，抑制连作茄子土传病害发生。Arthrobacter（节杆菌属）是一类广泛存在于土壤中的放线菌，具有高效降解有机污染物功能，CF处理中较多，可能与农药消毒诱导其繁殖，提高在土壤微生物生态系统中丰度有关[23]。BFC和BFN处理Paenisporosarcina和Aeromicrobium丰度较CN处理显著降低，其中Aeromicrobium菌体可产生抗生素，损害环境中细菌多样性。由此推断，作物轮作体系中有害微生物丰度相对减少。

与十字花科作物轮作后，不仅土壤细菌群落发生变化，同样真菌群落结构也显著改变。在MiSeq高通量测序中共鉴定出21个真菌菌属（见图4）。其中，Sordariomycetes_unclassified（粪壳菌属）、Humicola（腐质霉属）等腐生真菌，在轮作处理中较多。Chaetomiaceae_unclassified和Chaetomium（毛壳菌属）在BFN、BFC处理中丰度增加。Brown发现谷物、大麦等种子被毛壳菌和螺卷毛壳菌（C.cichliodes）侵染后，作物幼苗可免受镰刀菌伤害[24]。毛壳菌属在降解木质素，纤维素，酚酸和秸秆等方面优势显著[25]。Sordariomycetes_unclassified（粪壳菌属）可分解土壤、粪便、落叶与腐烂木材。Alternaria（链格孢菌属）在BFN处理中较高，木霉属和链格孢菌属，可促进植物生长[26]。在真菌群落中，轮作处理显著增加腐生菌种类，可分解土壤有机质，有助作物吸收有机碳等。本试验中发现，茄子与芥菜轮作后对真菌多样性影响较大，可能是由于芥菜中含有较高硫甙葡萄糖苷，施入土壤初期，硫苷降解产物异硫氰酸酯杀菌作用降低该处理（BFN）土壤致病真菌，同时也说明芥菜对土壤具消毒作用。李淑敏等研究发现，利用十字花科芸薹属蔬菜熏蒸大棚茄子连作土壤，可改善连作土壤理化性质，提高茄子产量，有效抑制茄子黄萎病发生[10]。吴凤芝等研究指出，不同作物根系分泌物直接影响土壤微生物种类和数量，使连作病原菌失去寄主或适宜生存环境，减轻土传病害发生[27]。本试验进一步证明芥菜熏蒸可缓解茄子连作障碍，但不同十字花科植物与茄子轮作对土壤微生物群落结构影响不同。十字花科植物中不同硫甙葡萄糖苷降解产物对土壤细菌和真菌作用机理，尚需进一步研究。

4 结论

芥菜与茄子轮作，在芥菜混入土壤初期增加土壤细菌多样性并降低真菌多样性，土壤微生物群落由真菌型向细菌型转变；土壤微生物群落结构发生变化，轮作后土壤内有益细菌丰度增加，说明芥菜与茄子轮作可缓解茄子连作障碍，有效防控茄子土传病害。

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Effect of different eggplant cultivated patterns on soil microbial diver-sity in greenhouse/

MENG Lingbo1,2,LIU Tongtong2,ZHANG Chunyi2,LI Shumin2,GAO Yu2,HUANG Peirong2
(1.School of Food Engineering,Harbin University,Harbin 150086,China;2.School of Resources and Environment,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

Eggplant cultivation in greenhouse is prone to causing continuous cropping obstacles which lead to soil borne diseases seriously and yield declined.In this experiment,two kinds of cruciferous crops(mustard and rapeseed)were selected to rotate with eggplants in greenhouse,which aimed to discover effects of this cropping rotation patterns on soil microbial diversity and community structure.MiSeq sequencing analysis results showed that the bacterial abundance in eggplant/rape rotation treatment and the bacterial diversity in eggplant/mustard rotation treatment were significantly higher than those in continuous cropping.MiS cluster analysis showed that bacterial community structure in eggplant/rapeseed and eggplant/mustard rotations treatments was very different from continuous eggplant cropping and pesticide fumigation.SoilFlavobacteriawas dominant species in these two rotation patterns that played important function in improving soil fertility and facilitating crop growth.Soil fungal diversity abundance decreased significantly in these two rotations patterns through MiS fungi cluster analysis,while the number ofChaetomiumand other saprophytic fungi increased,which was beneficial to improve content of soil organic matter and soil quality.Cruciferous crops rotated with eggplant could improve soil microbial diversity and the micro ecological environment.Compared with pesticide fumigation,it was an effective green and environmentally friendly method to solve the continuous cropping obstacle of eggplant.These research results provided new ideas to alleviate eggplant continuous cropping obstacle in sustainable production.

rotation;cruciferous crop;eggplant;soil microorganism

S641.1；S344；S154

A

1005-9369（2017）11-0018-08

时间2017-12-7 12:33:46 [URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20171207.1233.004.html

孟令波,刘彤彤,张春怡,等.棚室茄子不同栽培方式对土壤微生物多样性的影响[J].东北农业大学学报,2017,48(11):18-25.

Meng Lingbo,Liu Tongtong,Zhang Chunyi,et al.Effect of different eggplant cultivated patterns on soil microbial diversity in greenhouse[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(11):18-25.(in Chinese with English abstract)

2017-08-30

黑龙江省博士后科研启动基金（LBH-Q16140）；公益性行业（农业）科研专项（201503109）；黑龙江省自然科学基金面上项目(C2015016)

孟令波（1970-），男，副教授，博士，研究方向为土壤微生物。E-mail:menglingbo2004@126.com

*通讯作者：李淑敏，教授，博士生导师，研究方向为作物营养与施肥。E-mail:lishumin113@126.com