大豆脂肪酸含量积累动态及亚麻酸代谢候选基因筛选

李文滨，冯 雷，宋 伟，罗 健，毕文双，刘 月，徐玲秀，赵 雪

大豆脂肪酸含量积累动态及亚麻酸代谢候选基因筛选

李文滨，冯 雷，宋 伟，罗 健，毕文双，刘 月，徐玲秀，赵 雪

（东北农业大学大豆研究所，大豆生物学教育部重点实验室，农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150030）

大豆脂肪酸5种组分中亚麻酸含量是影响大豆品质主要因素之一，与其他4种脂肪酸比例直接影响大豆油脂品质特性及贮运加工，大豆油具有适宜亚油酸与亚麻酸比例。文章通过高效气相色谱法对品种‘合丰25’（高亚麻酸含量品种，5.94%）与加拿大稳定品系‘L-5’（低亚麻酸含量品种，2.75%）及其组配重组自交系群体中选取高/低亚麻酸品系各2份，盆栽试验分析脂肪酸组分及含量。结合KEGG中大豆脂肪酸代谢途径筛选与不饱和脂肪酸代谢相关候选基因，对筛选RIL群体后代品系发育各时期作实时定量PCR，分析其在‘合丰25’和‘L-5’及后代品系中表达模式。结果表明，相同基因在不同品种之间对亚麻酸含量调控机制不同，不同时期基因表达量对亚麻酸积累量具有不同程度影响。研究结果为探索大豆亚麻酸积累规律及其候选基因影响，选育理想脂肪酸组分比例大豆新品种提供参考。

大豆；脂肪酸；气相色谱；实时定量PCR

大豆是重要油料作物之一，是食用植物油主要来源[1-2]。大豆脂肪酸组分配比直接影响大豆油脂营养价值及贮运加工等环节，为决定大豆油脂品质最重要因素[3-4]。大豆脂肪酸由5种脂肪酸组成，包括饱和脂肪酸：棕榈酸、硬脂酸；不饱和脂肪酸：油酸、亚油酸、亚麻酸[5-7]。饱和脂肪酸无不饱和键，能量低、不易被人体消化吸收，利于大豆油贮存，不饱和脂肪酸以亚油酸为主（约55%），含有两个双键，易于吸收，是人体必需脂肪酸[8]；亚麻酸（C18∶3）因高度不饱和性易使大豆油氧化变质，营养价值低[9]。因此，降低大豆脂肪酸组分中亚麻酸含量成为重要育种目标之一。

大豆脂肪酸遗传受多基因控制且易受环境影响[10-12]，脂肪酸组分含量遗传涉及主效基因和多基因[13]，亚麻酸含量主效基因遗传率低，棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸主效基因遗传率均在70%以上[14-15]。Tang等分离获得5个FAD2基因拷贝[16]。Δ15-脂肪酸脱氢酶（FAD3），为一种微粒体ω-3脱氢酶，是决定亚麻酸产量关键酶，Li等从大豆基因组中克隆并分离出4个编码亚麻酸脱氢酶功能基因，与低亚麻酸含量密切相关[17]。Δ12-脂肪酸脱氢酶（FAD2），是决定亚油酸含量关键酶[18]。传统育种方法改良大豆脂肪酸遗传进展缓慢。目前，国内外大豆育种家利用分子标记挖掘多个与大豆油酸和亚麻酸含量相关QTL[19-21]。宋万坤等采用QTL元分析方法获得定位在10个连锁群上19个QTLs[22]，邹筱等利用QTL定位发现11个与油酸、亚麻酸相关标记[23]，南金平等利用回交导入系群体检测到47个QTLs[24]，但大豆各发育时期亚麻酸积累及相关基因各时期表达量分析鲜见报道。

本研究通过高效气相色谱法对品种‘合丰25’（高亚麻酸含量品种，5.94%）与加拿大稳定品系‘L-5’（低亚麻酸含量品种，2.75%）及其组配重组自交系群体中选取高/低亚麻酸品系各2份，通过盆栽试验分析脂肪酸组分、含量及相关性，同时筛选具代表性高/低亚麻酸含量大豆品系，分析不同生育时期亚麻酸含量动态变化，结合KEGG数据库中大豆脂肪酸代谢途径筛选与不饱和脂肪酸代谢相关基因，分析其表达模式，为探索大豆亚麻酸积累规律及选育理想脂肪酸组分比例大豆新品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

合丰25（高亚麻酸含量品种，5.94%）、加拿大稳定品系L-5（低亚麻酸含量品种，2.75%）、杂交组配RIL重组自交系群体F7代。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

试验于2015年在东北农业大学向阳试验实习基地进行，从检测群体中选取高/低亚麻酸品系，高亚麻酸品系JY182、JY142，低亚麻酸品系JY20、JY83作盆栽试验，定期定量浇水，施肥，生长条件一致环境下发育至成熟。盆栽材料定期取样，测定亚麻酸含量，分析籽粒中亚麻酸积累动态，作荧光定量分析。

1.2.2 仪器试剂

Trizol试剂、反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒SYBR®ExScriptTM RT-PCR Kit、DNA Marker购自天根公司；抗坏血酸购自天津市瑞金特化学品有限公司；DEPC处理水购自上海生工；LightCycler 480系统96孔板、安捷伦N6980气相色谱仪购自美国安捷伦公司；LightCycler 480 Sealing Foil购自自罗氏诊断公司；电泳琼脂糖购自西班牙；Light ABI Prism 7500 SDS购自美国；荧光定量PCR仪、低温冷冻离心机和台式高速低温离心机购自Beckman公司；三洋-80℃超低温冰箱购自日本；-20℃低温冰箱，超净工作台等。

1.2.3 取样方法

自始粒期R5开始，每7 d取一次样，幼荚（R5）直至完熟期（R8），取样10次，每株仅取样一次，第1~2次取样对应始粒期，第3~6次取样对应鼓粒期，第7~8次取样对应黄熟期，第9~10次取样对应完熟期。从主茎顶端第二、三个节位取样，样品分两份，一份于105℃烘箱杀青5 min后，50℃烘箱烘干至恒重，测定籽粒亚麻酸组分含量；另一份样品荚皮与籽粒迅速分开放入-80℃冰箱保存，提取RNA，作荧光定量分析，检测已筛选出与亚麻酸代谢相关基因各时期表达量，参照文献[24-26]方法。

1.2.4 样品脂肪酸提取及提取方法

各时期待测样品大豆籽粒，去除杂质，每个样品取5~10粒，粉碎并通过0.25 mm孔径样品筛，称取0.5 g豆粉，加入10 mL离心管中，向离心管中加入5 mL 1%甲醇-氢氧化钠溶液，斡旋震荡15 s，充分混匀，静置30 min。向离心管中滴入5滴10%乙酸，加入3 mL正庚烷，充分震荡。静置2 min，吸取上清液，经过滤灭菌器过滤，取1.5 mL上机测定。进样1 μL，乙酸乙酯冲洗微量进样器。样品脂肪酸提取方法参照文献[4]。

1.2.5 样品脂肪酸测定

研究所用材料RIL群体为大田取样，群体第7代及亲本为盆栽取样。采用安捷伦N6980气相色谱仪测定样本脂肪酸含量，脂肪酸组分数值计算参照文献[27-29]方法。

1.2.6 荧光定量分析

1.2.6.1 候选基因筛选与引物设计

根据KEGG数据库中大豆脂肪酸代谢途径筛选与脂肪酸代谢相关基因[30-32]，依据基因注释及前人报道，选择与脂肪酸代谢相关基因（见表1）作实时荧光定量分析。筛选出基因设计引物，根据引物设计原则选择实时荧光定量PCR引物。数据分析采用2-ΔΔCt法作相对定量分析，计算过程：分别计算每组ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt内参基因，根据ΔΔCt求出2-ΔΔCt。采用 Light cycler480 罗氏荧光定量仪作实时荧光定量PCR。荧光定量程序；94℃，2 min，94℃、30 s，60℃，30 s，72℃，30 s，72℃，10 min，38个循环。

表1 筛选出基因及对应引物Table 1 The screened genes and the corresponding primers

1.2.6.2 待测样品RNA提取及反转录

按照RNA提取试剂盒说明书操作提取RNA。将各时期待测样在液氮中研磨后加入1 mL Trizal混匀振荡，室温下静置5 min使样品RNA与其他物质分离，再加入200 μL氯仿涡旋振荡，充分乳化，使蛋白质与RNA分离，室温静置5 min后，1 2000 r·min-1， 4 ℃离心15 min，吸上清液600 μL于新管中，加入等体积异丙醇混匀，室温静置10 min，使RNA沉淀，12 000 r·min-1，4℃离心10 min后去上清液，加入1 mL 75%乙醇清洗，进一步提纯。离心干燥，加入DEPC水溶解RNA。样品RNA反转录为cDNA保存，供荧光定量使用。

1.3 数据分析

样品表型值采用SPASS17.0作统计分析。

2 结果与分析

2.1 代表性群体后代筛选

对2015年收获180份RIL群体后代作气相色谱分析，测量后代脂肪酸各组分含量（见表2）。根据亚麻酸含量结果筛选JY142与JY182两份材料作为亚麻酸高值载体，JY20与JY83两份材料为亚麻酸低值载体作盆栽试验。

表2 RILL群体后代中亚麻酸高/低值载体筛选结果Table 2 RILL group of descendants of linolenic acid high/low value carrier screening results

2.2 大豆品籽粒脂肪酸含量积累动态

由图1可知，棕榈酸与硬脂酸在始粒期（R5期）合成，积累量逐渐降低，在鼓粒期（R6期)至完熟期（R8期）积累量降到最低，合成总量基本保持不变；始粒期（R5期）油酸积累量逐渐上升，鼓粒期（R6期）大豆籽粒中油酸组分积累量除合丰25以外持续上升，其他材料油酸积累量下降，鼓粒后期合丰25积累量与其他材料同时下降，完熟期（R8期）降到最低；亚油酸积累量始粒期（R5期）至完熟期（R8期）一直上升。鼓粒期，合丰25与JY20亚油酸积累量出现波动。始粒期亚麻酸积累量最高，始粒期后逐渐降低，成熟期开始趋于平稳，完熟期亚麻酸积累量保持不变，鼓粒期合丰25亚麻酸积累量出现波动，亚麻酸积累量降至最低后再上升，成熟期趋于平稳。

2.3 重要候选基因实时荧光定量PCR结果

由图2可知，基因Glyma.14G194300、Glyma.07G046200、 Glyma.20G245500、 Glyma.13G068600在合丰25、L-5、JY20、JY83、JY142、JY182中，始粒期表达量逐渐增加，始粒期亚麻酸积累量达到最大后开始逐渐下降。鼓粒期基因Glyma.14G194300表达量达到最大后逐渐下降，此时亚麻酸积累量降到最低并趋于平稳。基因Glyma.20G158300、 Glyma.07G151300、 Glyma.07G254500在合丰25、JY20、JY83中，始粒期开始表达量逐渐降低或不表达，始粒期亚麻酸积累量达到最大后逐渐下降。鼓粒期基因Glyma.07G151300、Glyma.07G254500表达量开始增加，此时亚麻酸积累量降到最低并趋于平稳。

2.4 亚麻酸含量与基因表达量相关性分析结果

材料各生育期亚麻酸含量与基因表达量相关性分析结果显示，基因Glyma.14G194300、Glyma.20G245500表达量与HF25、JY20亚麻酸含量呈正相关，与JY83亚麻酸含量呈负相关，基因 Glyma.20G158300、 Glyma.16G003500、 Glyma.07G151300、Glyma.07G254500 表 达 量 与 HF25、JY20、JY83亚麻酸含量呈负相关，基因Glyma.07G046200、 Glyma.13G068600 表 达 量 与 HF25、JY83亚麻酸含量呈负相关，与JY20亚麻酸含量呈正相关。

图1 大豆籽粒高/低值载体脂肪酸含量积累动态曲线Fig.1 Accumulation curves of fatty acids in soybean kernels with high or low values

图2 实时定量PCR结果Fig.2 Real time quantitative PCR results

表3 亚麻酸含量与基因表达量相关性分析Table 3 Correlation analysis of linolenic acid content and gene expression

3 讨论与结论

本研究选择RIL重组自交系亲本，成熟时期亚麻酸含量差异较大，其他4种组分含量，基本一致，亲本组配群体后代表现较大性状分离几率，有助于选择高油酸且低亚麻酸品系。利用气相色谱法及实时荧光定量PCR测定大豆籽粒各生育期脂肪酸组分，结果显示，大豆籽粒中亚麻酸积累量从始粒期开始迅速上升，进入鼓粒期逐渐降低，成熟期趋于平稳直到完熟期保持不变，与徐杰等在大豆籽粒发育过程中脂肪酸组分积累动态研究结果一致[33]。结果表明，大豆脂肪酸组分含量积累趋势普遍一致，但亚麻酸积累动态在鼓粒期表现显著差异，鼓粒期测定亚麻酸含量可选择优良品系。

大豆籽粒脂肪酸组分积累在各生长发育期受自然环境影响，温度对亚麻酸与棕榈酸影响较大，庄炳昌等采用人工气候箱研究表明，夜间温度升高棕榈酸含量升高，亚麻酸含量降低[34]。水分与光照对大豆籽粒发育过程中脂肪酸组分积累影响较大，米景春等研究表明，大豆籽粒脂肪酸组分积累在干旱条件下不同程度降低[35]。刘兵等遮荫研究表明，大豆生殖生长期遮荫，影响脂肪酸积累[36]。与前人研究相比，本研究采用室外盆栽，为保证生长条件一致，试验过程中盆栽以混合均匀等量自然土作营养基质，水分等量浇灌，温度、光照与自然条件相同。与大田相比盆栽可保证土壤均一，营养均衡，避免大田中地力不均影响。水分等量避免极端干旱气候影响，温度、光照均为自然条件，避免人为因素影响。

实时定量PCR结果、亚麻酸含量与基因表达量相关性分析结果表明，基因Glyma.07G046200、Glyma.20G245500、Glyma.13G068600为明显双峰分布，在始粒期与黄熟期出现两个表达高峰，基因Glyma.16G003500表达呈典型多峰分布，表明在大豆籽粒发育过程中亚麻酸积累量受多基因调控，在不同生育期基因表达量对亚麻酸积累量影响不同。基因Glyma.14G194300、Glyma.20G245500在HF25、JY20中对亚麻酸积累量有正调控作用，在JY83基因对亚麻酸积累量有负调控作用。基因Glyma.20G158300、Glyma.16G003500、Glyma.07G 151300、Glyma.07G254500 在 HF25、JY20、JY83中对亚麻酸含量有负调控作用。但大豆始粒期至完熟期亚麻酸含量表达量相对较低，对大豆籽粒亚麻酸积累量影响较小。

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Accumulation dynamics of fatty acid in soybean seed and screening of candidate gene related to linolenic acid metabolism/LI Wenbin,FENG Lei,

SONG Wei,LUO Jian,BI Wenshuang,LIU Yue,XU Lingxiu,ZHAO Xue
(Institute of Soybean Research,Key Laboratory of Soybean Biology in Chinese of Ministry Education,Key Laboratory of Soybean Biology and Breeding(Genetics)of Agriculture Ministry,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Linolenic acid content,as one of thefive fatty acid components in soybean,is one of the important factors affecting the quality of soybean,its composition and ratio is also directly related to the quality of soybean oil,storage and processing etc.In comparison with other plant oil,soybean oil has better linoleic acid content and linolenic acid ratio.This study analyzed fatty acid content and proportion of'Hefeng 25'(high linolenic acid content of 5.94%varieties,Canada)and stable strains'L-5'(low linolenic acid content of 2.75%varieties),two lines from recombinant inbred lines derived from'Hefeng 25'and'L-5'through gas chromatography method.Additionally,combined with the metabolic pathways of KEGG in soybean fattyacids were screened and unsaturated fatty acid metabolism related candidate genes and screening lines produced during different developmental stages were analyzed by real-time quantitative PCR in'Hefeng 25'and'L-5'expression patterns.The results showed that the same gene in different varieties of linolenic acid content of different regulatory mechanisms,both positive and negative regulations of gene expression regulation in different periods had different degrees of influence on the accumulation of linolenic acid.The results,for exploring the regularity of soybean linolenic acid accumulation and the influence of its candidate genes,for breeding the ideal fatty acid composition and proportion of new soybean varieties,provided theoretical reference.

soybean;fatty acid;gas chromatography;real-time quantitative PCR

S565.1

A

1005-9369（2017）11-0001-08

时间2017-12-6 12:03:11 [URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20171206.1203.002.html

李文滨,冯雷,宋伟,等.大豆脂肪酸含量积累动态及亚麻酸代谢候选基因筛选[J].东北农业大学学报,2017,48(11):1-8.

Li Wenbin,Feng Lei,Song Wei,et al.Accumulation dynamics of fatty acid in soybean seed and screening of candidate gene related to linolenic acid metabolism[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(11):1-8.(in Chinese with English abstract)

2017-08-27

农业部大豆产业技术体系（CARS-04-PS04）；国家十二五科技支撑计划项目（2011BAD35B06）；黑龙江省自然科学基金面上项目（C2015011）；国家自然基金项目（31671717）

李文滨（1958-），教授，博士，博士生导师，研究方向为大豆遗传育种。E-mail:wenbinli@neau.edu.cn