葡萄糖-天门冬酰胺体系中丙烯酰胺的生成规律研究

陈卓静，关亚飞，丁城，吴茜*

(1.湖北工业大学 生物工程与食品学院，武汉 430068；2.工业发酵湖北省协同创新中心， 武汉 430068；3.湖北省食品发酵工程技术研究中心，武汉 430068； 4.武汉市华测检测技术有限公司，武汉 430223)

葡萄糖-天门冬酰胺体系中丙烯酰胺的生成规律研究

陈卓静1,2,3，关亚飞4，丁城1,2,3，吴茜1,2,3*

(1.湖北工业大学 生物工程与食品学院，武汉 430068；2.工业发酵湖北省协同创新中心， 武汉 430068；3.湖北省食品发酵工程技术研究中心，武汉 430068； 4.武汉市华测检测技术有限公司，武汉 430223)

对葡萄糖-天门冬酰胺(Glu-Asn)模拟体系中丙烯酰胺的生成规律进行了研究。探讨了氨基酸种类、反应底物摩尔比例、加热时间、加热温度和pH等单因素对丙烯酰胺生成量的影响。选取加热时间、加热温度和pH进行正交试验优化得到丙烯酰胺的最大生成量条件：0.1 mol/L的等摩尔比Glu-Asn体系溶液于180 ℃(油浴)、pH 8.0(PBS)的条件下加热30 min，丙烯酰胺的生成量为(164.80±13.26) nmol，在此基础上进行进一步的抑制作用研究。

丙烯酰胺；麦拉德反应；葡萄糖；天冬酰胺；正交

麦拉德反应是食品加工过程中常见的一种由还原糖和氨基酸或者是蛋白质在高温情况下所发生的反应，食品中的许多风味物质便是在此过程中形成的。而作为其反应的副产物丙烯酰胺，也通常在含有高淀粉含量的热加工食品中被检测出来。据Yaylayan等[1]研究得出糖类物质(主要是指还原糖)和天门冬酰胺作为主要的前体物质来参加麦拉德反应并生成丙烯酰胺，同时也有相关文献报道甘油三酯氧化反应的丙烯醛途径也可能是生成丙烯酰胺的另外一条通道[2]。影响丙烯酰胺的形成有多种因素，就其反应物本身而言，反应物的种类、含量以及所占比例对丙烯酰胺的形成具有一定影响[3]；就其反应状态而言，加热时间、加热温度以及pH对丙烯酰胺的生成也具有重大影响[4,5]。本文总结了以下因素：氨基酸种类、葡萄糖-氨基酸比例、加热温度、加热时间以及pH对丙烯酰胺生成的影响。详细地探讨了影响的方式，同时结合正交实验分析得出丙烯酰胺的最大生成量的条件，为后来丙烯酰胺的抑制提供实验基础。

1 仪器和材料

1.1 仪器与试剂

丙烯酰胺标准品(99.9%) 德国Dr.E公司；甲醇、甲酸(色谱纯) 美国Fisher公司；亚铁氰化钾、硫酸锌、磷酸二氢钠、葡萄糖、磷酸氢二钠、正己烷 国药集团化学试剂有限公司；天门冬酰胺 日本Bioship公司。

岛津LC-20AT高效液相色谱仪 日本岛津公司；Superclean ENVI C18固相萃取小柱(3 mL) 美国Superclean公司；Waters Atlantis○RT3色谱柱 美国Waters公司；0.22 μm水系针筒式微孔滤膜过滤器 上海楚柏实验室设备有限公司；Milli-Q水纯化系统 法国Millipore公司；冷冻离心机 德国Eppendorf公司；万分之一电子天平 METTLER TOLEDO公司；油浴锅(HH-WO，5 mL) 上海一凯仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 麦拉德反应体系的建立

准确量取0.5 mL的0.2 mol/L的氨基酸和0.5 mL的0.2 mol/L的葡萄糖组成等摩尔比的反应体系(0.1 mol/L) 1 mL溶液置于25 mL密封反应管中，油浴加热进行麦拉德反应。产物取出后冰浴冷却，加入5 mL超纯水超声提取10 min，于4 ℃下离心20 min(11000 r/min)，定容至10 mL，样品处理后进行HPLC分析测定丙烯酰胺含量。

1.2.2 氨基酸种类对丙烯酰胺生成含量的影响

选取具有非极性侧链的丙氨酸(Ala)、带有极性侧链的天门冬酰胺(Asn)、带正电荷侧链的赖氨酸(Lys)以及带负电荷侧链的谷氨酸(Glu)分别与葡萄糖进行反应。反应体系如1.2.1所示，反应温度为180 ℃，时间为30 min，每组实验平行3次。

1.2.3 不同底物比例对丙烯酰胺生成含量的影响

由于一水合天门冬酰胺(Asn·H2O)在室温(20 ℃)下的溶解度为30 g/L (0.2 mol/L)，故固定天门冬酰胺的量为0.2 mol/L，即分别量取0.5 mL的0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mol/L的葡萄糖溶液加入0.2 mol/L Asn溶液中(构成Glu-Asn为0，1∶4，1∶2，1∶1，2∶1，4∶1的反应体系)进行反应。反应体系如1.2.1所示，反应温度为30 ℃，反应时间为30 min，以确定不同比例的底物对丙烯酰胺生成量的影响，每组实验平行3次。

1.2.4 加热温度对丙烯酰胺生成含量的影响

0.1 mol/L的等摩尔比Glu-Asn体系溶液分别置于100，120，140，160，180，200 ℃下加热10 min和30 min，样品处理后进行HPLC分析测定丙烯酰胺含量，每组实验平行3次。

1.2.5 加热时间对丙烯酰胺生成含量的影响

0.1 mol/L的等摩尔比Glu-Asn体系溶液分别置于140，160，180，200 ℃下加热5，10，20，30，40 min，样品处理后进行HPLC分析测定丙烯酰胺含量，每组实验平行3次。

1.2.6 pH对丙烯酰胺生成含量的影响

不同pH值体系的配制。缓冲体系采用PBS溶液母液。0.2 mol/L Na2HPO4：称取71.6 g Na2HPO4·12H2O溶于1000 mL水中；0.2 mol/L NaH2PO4：称取31.2 g NaH2PO4·2H2O溶于1000 mL水中。

1.2.7 正交实验确定丙烯酰胺生成最大量的条件

选取了加热时间、加热温度以及pH作为单因素，设计三因素三水平的正交实验L9(34)，优化得到了丙烯酰胺生成最大量的条件，最终通过验证实验得以证明。

1.3 统计学分析

数据以平均值±标准偏差(X±S)表示，采用SPSS 13.0软件进行方差分析(ANOVA)，显著性差异采用Duncan's多重比较法，表现为p<0.05。各图由Origin 8.0 Pro绘制，正交分析结果通过Mini Tab 15软件进行，采用p检验法进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同单因素丙烯酰胺生成含量的影响

2.1.1 氨基酸种类对丙烯酰胺生成含量的影响

图1 不同氨基酸对丙烯酰胺生成量的影响(n=3)Fig.1 Effect of different amino acids on the production of acrylamide (n=3)

注：AA为丙烯酰胺。

由图1可知，不同的氨基酸与葡萄糖反应生成丙烯酰胺的含量存在很大差异。1 mL等摩尔比的反应体系(0.1 mol/L)中测得的结果表明：丙氨酸(Ala)与葡萄糖反应的产物中并没有检测出丙烯酰胺；赖氨酸(Lys)体系中生成了少量的丙烯酰胺，为3.86 nmol；谷氨酸(Glu)体系中丙烯酰胺含量为28.18 nmol；而天门冬酰胺(Asn)体系中丙烯酰胺的含量最大，且显著大于其他组，达到147.80 nmol。这说明天门冬酰胺作为主要前提物质参加了丙烯酰胺的形成。同时据相关报道，通过同位素(N15)示踪原子研究表明：丙烯酰胺骨架中的碳原子均来自于天门冬酰胺，与还原糖中的碳骨架无关[6]。因此可以推测，在含有天门冬酰胺较多的食品中，通过适当的前处理，如加入天门冬酰胺酶来将其分解，可以在一定程度上阻止丙烯酰胺的形成，同时也较好地保存了食品的营养价值。

2.1.2 不同底物比例对丙烯酰胺生成含量的影响

Glu-Asn体系中底物比例不同所导致的丙烯酰胺生成含量结果见图2。

图2 不同添加比例对丙烯酰胺生成量的影响(n=3)Fig.2 Effect of different addition ratios on the production of acrylamide (n=3)

注：AA为丙烯酰胺。

当单独加热天门冬酰胺(比例为0)和单独加热葡萄糖(比例为∞)时，体系中均没有检测出丙烯酰胺；而当Glu-Asn摩尔比为1∶1时，生成的丙烯酰胺最多，为137.58 nmol ；而当Glu-Asn摩尔比分别为1∶4和4∶1时，丙烯酰胺含量分别为24.24 nmol和41.46 nmol，同时摩尔比分别为1∶2和2∶1时，丙烯酰胺含量分别为47.92 nmol和103.39 nmol。可以看出：两个相反的比例对比，丙烯酰胺的生成含量前者的均小于后者，可以推测葡萄糖过量所带来的影响大于天门冬酰胺过量所带来的影响。

2.1.3 加热温度对丙烯酰胺生成含量的影响

分别考察了短时间(10 min)和长时间加热(30 min)的情况下，分别于100，120，140，160，180，200 ℃的不同加热温度对丙烯酰胺生成的影响结果，见图3和图4。

图3 10 min下不同加热温度对丙烯酰胺含量的影响 (n=3)Fig.3 Effect of different heating temperatures on the content of acrylamide at 10 min (n=3)

注：AA为丙烯酰胺。

由图3可知，在加热10 min的情况下，100 ℃和120 ℃下基本检测不出丙烯酰胺，丙烯酰胺从140 ℃下开始检出，为1.79 nmol，随着加热温度的升高，丙烯酰胺含量逐渐变大，在实验条件规定范围内，加热温度为200 ℃时，达到最大，为38.44 nmol。

图4 30 min下不同加热温度对丙烯酰胺含量的影响 (n=3)Fig.4 Effect of different heating temperatures on the content of acrylamide at 30 min (n=3)

注：AA为丙烯酰胺。

由图4可知，在加热30 min的情况下，从120 ℃开始即可检测到丙烯酰胺的生成，为8.71 nmol，随着加热温度的增加，到180 ℃时，丙烯酰胺含量达到最大值，为157.91 nmol，继续随着温度的升高，200 ℃时丙烯酰胺含量反而降低至132.51 nmol，整个曲线呈现出一个先升高后降低的过程在短时间加热过程中，随着温度的升高，葡萄糖的降解速率加快，加快了体系中丙烯醛的生成率，因此可能通过丙烯醛途径形成的丙烯酰胺的含量增加[7]，形成了更多的丙烯酰胺。长时间加热过程中，当温度在180～200 ℃时，丙烯酰胺的生成含量反而降低，可能是丙烯酰胺的生成作为一个可逆反应，其消除速率大于生成速率的缘故[8]。

2.1.4 加热时间对丙烯酰胺生成含量的影响

加热时间对丙烯酰胺生成含量的影响见图5。

图5 不同加热时间(0，5，10，20，30，40 min) 对丙烯酰胺含量的影响(n=3)Fig.5 Effect of different heating time (0,5,10,20,30,40 min) on the content of acrylamide (n=3)

注：AA为丙烯酰胺。

140 ℃和160 ℃的情况下，前10 min几乎无丙烯酰胺检出，随着加热时间的增加，丙烯酰胺的含量逐渐增大，且到40 min时都达到最大值，分别为54.10 nmol和103.39 nmol。180 ℃和200 ℃的情况下，在5 min能检测到少量的丙烯酰胺，分别为7.46 nmol和14.26 nmol，随着时间的增加，丙烯酰胺含量先上升后下降，且200 ℃在20 min时率先达到最大值为196.37 nmol，180 ℃在30 min达到最大值为173.40 nmol，在时间上比200 ℃更晚，且最大值含量小于200 ℃时的含量。同时加热到40 min以后，180 ℃下丙烯酰胺却大于200 ℃，分别为118.88 nmol和76.62 nmol。

可以看出高温长时间加热会降低丙烯酰胺的含量，可能随着加热时间的延长，丙烯酰胺自身发生的分解反应或者与其他物质发生了反应，从而降低了丙烯酰胺的含量。同时也看出高温情况下，丙烯酰胺会提前形成，这与Robert等的研究相一致[9]。

2.1.5 pH对丙烯酰胺生成含量的影响

pH 6.0～8.0对丙烯酰胺生成含量的影响见图6。

图6 不同pH下丙烯酰胺的含量变化曲线 (n=3)Fig.6 Changes of acrylamide content at different pH values (n=3)

注：AA为丙烯酰胺。

由图6可知，pH对Glu-Asn体系中的丙烯酰胺的形成具有显著的影响，随着pH的上升，到7.5时，生成丙烯酰胺的量达到最大，为166.82 nmol，继续增大pH，则反倒减小。由于pH对麦拉德反应具有较大影响，且在大于7.0时，最易发生麦拉德反应，因此可以预见丙烯酰胺也在此时会达到最大生成量，与实验结果相符。

2.2 正交实验

根据上述单因素实验结果，选取加热时间、加热温度以及pH作为影响因子，进行三因素三水平的正交试验L9(34)，反应体系为0.1 mol/L等摩尔比的Glu-Asn溶液1 mL，按照1.2.1步骤进行反应，具体参数见表1。

表1 参数与水平Table 1 Parameters and levels

正交实验结果见表2。

表2 三因素三水平正交实验设计方法下的丙烯酰胺含量Table 2 The acrylamide content by three-factor and three-level orthogonal experimental design

续 表

由表2可知，3个因子对丙烯酰胺生成含量的影响大小依次是：加热温度>pH>加热时间。此时的最佳组合为A2B2C3。即在1 mL的0.1 mol/L等摩尔比Glu-Asn溶液的反应体系中，加热时间为30 min，加热温度为180 ℃，pH为8.0时，生成的丙烯酰胺含量最大，此选择的均值主效应图见图7。

图7 丙烯酰胺生成量的均值主效应图Fig.7 The mean main effect diagram of acrylamide production

注：AA:丙烯酰胺。

用p检验法对正交实验进行方差分析，结果见表3。

表3 丙烯酰胺含量的方差分析Table 3 Variance analysis of acrylamide content

由表3可知，加热时间和pH对丙烯酰胺含量具有显著性影响(P<0.05)，加热温度对丙烯酰胺含量具有极显著性影响(P<0.01)。此结果也证明了Glu-Asn反应体系的正交实验能够较准确地拟合实验数据，客观地反映了丙烯酰胺的生成情况。

2.3 正交验证实验

按照正交实验得到丙烯酰胺生成最大量的条件进行验证实验，即1 mL的0.1 mol/L等摩尔比Glu-Asn溶液置于25 mL的密封管中油浴加热，加热时间30 min，加热温度180 ℃，pH 8.0，按照1.2.1处理并测定丙烯酰胺含量，实验重复3次，得到丙烯酰胺的含量为(164.80±13.26) nmol，与正交实验其他相比，为最大生成量，故认为在此条件下，丙烯酰胺达到最大生成值。

3 讨论

不同的氨基酸与还原糖反应得到的丙烯酰胺含量有着很大差异。Ezeji等研究了各种氨基酸作为前体物质发现不同的氨基酸生成丙烯酰胺含量不同[10]。本实验表明：天门冬酰胺与还原糖反应得到丙烯酰胺的量最多。这也说明富含天门冬酰胺的食品，例如土豆、小麦、黑麦等食物加工易生成丙烯酰胺[11-13]，因此可以通过减少原材料中天门冬酰胺的含量来降低食品中丙烯酰胺的形成。

随着加热温度的升高，丙烯酰胺的生成含量不断变大，且温度升高还促进了丙烯酰胺提早生成，说明伴随温度提升大大强化了丙烯酰胺的形成动力学过程[14]，pH 8.0也在麦拉德反应最佳反应pH条件左右，加大了丙烯酰胺的形成可能。同时高温长时间加热反倒降低丙烯酰胺的含量，考虑可能是以下3种情况：第一是高温长时间加热到后期生成的丙烯酰胺可能和其他物质发生反应，导致其含量下降；第二是考虑到丙烯酰胺的生成作为一种形成-消除的动力学反应，到后期随着丙烯酰胺含量的增加，消除动力学逐渐占据主导地位，从而使丙烯酰胺的含量下降[15]；第三则可能是丙烯酰胺作为一种酰胺类物质，到后期进一步发生迈克尔加成或是聚合反应导致其含量下降[16]。

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StudyontheFormationRuleofAcrylamideinModelSystemofGlucose-Asparagine

CHEN Zhuo-jing1，2，3, GUAN Ya-fei4, DING Cheng1,2,3, WU Qian1,2,3*

(1.College of Bioengineering and Food, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China; 2.Industrial Fermentation and Collaborative Innovation Center of Hubei Province, Wuhan 430068, China；3.Hubei Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology, Wuhan 430068, China;4.Wuhan Center Testing International Co.,Ltd., Wuhan 430223, China)

The formation rule of acrylamide in the simulation system of glucose-asparagine (Glu-Asn) is studied. The effects of amino acid species, molar ratio of reaction substrate, heating time, heating temperature and pH on the production of acrylamide are discussed. Select the heating time, heating temperature and pH for orthogonal test to optimize the maximum production conditions of acrylamide: 0.1 mol/L equimolar ratio of Glu-Asn system solution is heated at 180 ℃ (oil bath), pH 8.0 (PBS) for 30 min. Acrylamide generation amount is (164.80±13.26) nmol, and subsequent inhibiting effect is studied on this basis.

acrylamide;Maillard reaction;glucose;asparagine;orthogonality

TS201.24

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.005

1000-9973(2017)12-0023-05

2017-06-28 *通讯作者

陈卓静(1993-)，女，湖北枣阳人，硕士，研究方向：功能性食品发酵。