调味粉中罂粟碱LAMP检测方法建立及试剂盒研制

杨柳，陈宇飞，王磊

(吉林工商学院 食品工程学院，长春 130507)

调味粉中罂粟碱LAMP检测方法建立及试剂盒研制

杨柳，陈宇飞，王磊

(吉林工商学院 食品工程学院，长春 130507)

建立调味粉中罂粟碱LAMP(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)检测方法，并研制出配套试剂盒。根据罂粟碱的特异性基因序列设计引物，对12种罂粟、11种香辛料和1种虞美人核酸样品进行特异性、最佳温度筛选及敏感性实验，根据优化后的反应条件，组装试剂盒，并采用试剂盒对市售的8种调味粉进行检测。结果表明：12种罂粟和虞美人发生了特异性反应，最佳反应温度为65 ℃，LAMP检测最低浓度达70 pg/μL，敏感性是PCR检测的10倍。市售8种调味粉中，有1种含有罂粟碱成分。实验所建立的检测方法及研制的试剂盒对调味粉中掺加罂粟粉检测具有重要意义。

调味粉；罂粟碱；LAMP；浊度法；荧光法；试剂盒

食品行业中某些不法商贩，为了牟取暴利，利用罂粟壳的成瘾特性，在食品尤其是火锅香料、调料中进行了添加，对消费者的身体和心理造成严重的伤害[1]。罂粟为一年生草本植物，含有的生物碱包括罂粟碱、吗啡、那可丁等20多种[2]。其中，罂粟碱是自然界中存在的一种重要的苄基异喹啉类生物碱，在阿片类植物如罂粟的壳和籽中含量较高[3]，久服易成瘾，过量摄入会引起心律不齐[4]。

对于罂粟碱等生物碱的检测，国内并无统一的国家标准，给食品监督管理工作带来难度[5]。文献中关于食品掺加罂粟碱的检测方法有高效液相色谱法[6]、PCR法[7]、酶联免疫法[8]等，这些方法存在灵敏度低、干扰严重、操作繁琐、检测时间长等问题[9]。因此，急需建立一种更加准确、快速和简便的检测方法。

LAMP技术，是由日本科学家Notomi等[10]于2000年发明的。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，在链转换DNA聚合酶的作用下恒温扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点[11]。目前，LAMP技术在检测致病菌[12]、转基因[13]、耐药基因[14]、寄生虫[15]等方面被广泛应用。但是迄今为止，还未见LAMP技术用于检测罂粟碱方面的报道。

本研究的目的是建立罂粟碱LAMP检测方法并开发配套试剂盒，对调味粉中掺加罂粟粉的检测与监测具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

罂粟：收集于东北三省；香辛料：购于长春欧亚超市；虞美人：采自长春北湖湿地公园；复合调味料：购于长春市光复路市场。

1.1.2 试剂

Tris-HC 上海杰美基因医药科技有限公司；Triton X-100 上海联硕生物科技有限公司；甜菜碱、Chelex-100 北京索宝生物科技有限公司；dNTP 美国Pharmacia公司；NP-40 西安晶彩生物科技有限公司；Takara试剂盒 宝生物工程(大连)有限公司；氢氧化钠、EDTA、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁、氯化锰 广州西陇化工有限公司；琼脂糖 北京沃比森科技有限公司； LAMP法DNA扩增试剂盒、LAMP反应管、荧光染料 日本荣研化学株式会社。

1.1.3 仪器

La-320C实时浊度仪 日本荣研化学株式会社；CHB-100HB-100型恒温金属浴 杭州博日科技有限公司；NanoQ微分光光度计 北京博奥晶典生物技术有限公司；ST5型凝胶成像仪 VILBER公司；ETC811型基因扩增仪 苏州东胜兴业科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品核酸提取

对12种罂粟、11种香辛料和1种虞美人分别进行3次液氮研磨，称取100 mg样本，使用Takara试剂盒，按照说明书提取DNA。

1.2.2 特异性基因及LAMP反应引物设计

对罂粟碱基因序列进行生物信息学分析，确定罂粟碱靶基因序列。采用王丽等[16]的方法设计3套LAMP基因引物，见表1。

表1 LAMP引物设计Table 1 LAMP primers design

1.2.3 LAMP反应体系建立

参考王瑾等[17]的方法建立LAMP反应体系，其中 5 pmol F3 和 B3，20 pmol LB和LF。将反应温度设定为60～67 ℃，将反应时间设定为60 min，采用双蒸水作为阴性对照。

1.2.4 LAMP反应原理

1.2.4.1 浊度法

根据焦磷酸镁白色沉淀，利用浊度仪进行实时检测。

1.2.4.2 荧光法

在LAMP反应体系中加入钙黄绿素，目视检测。

1.2.5 最佳引物筛选实验

将建立的LAMP反应体系温度设定为64 ℃恒温，以核酸浓度较高的8号罂粟为对象，分别利用PA7，PA48和PA100 3套LAMP引物对其进行扩增，筛选最佳引物。

1.2.6 最佳温度筛选实验

用筛选出的最佳引物进行温度优化实验，设置温度为60～67 ℃，梯度为1 ℃，以8号罂粟样本为对象，筛选最佳温度，确立最佳实验体系。

1.2.7 特异性实验

在最佳实验体系下，采用浊度法进行特异性验证实验。样品为12种罂粟、11种香辛料和1种虞美人。

1.2.8 敏感性实验

以8号罂粟基因组为对象，定量后将总DNA进行10倍稀释，使得最终DNA浓度分别为70,7.0,0.7 ng/μL和70，7.0，0.7，0.07 pg/μL，阴性对照为双蒸水，分别采用荧光显色法和浊度法检测LAMP 方法的敏感性。

PCR反应采用袁瑛娜等[15]的方法，对比PCR反应与LAMP反应的敏感性。

1.2.9 试剂盒组装及验证实验

根据确立的最佳引物、聚合酶及相关的试剂组装LAMP检测试剂盒，对市售8种复合调味粉进行检测，并与国标检测法进行对比实验。

2 结果与分析

2.1 引物筛选实验结果

由图1可知，3套引物对模板进行LAMP扩增，在60 min内，PA7引物组没有发生扩增反应，PA48引物组在24 min时的浊度为0.056，即刚刚开始扩增，而PA100引物组浊度为0.3498，最先发生LAMP引物，因此选PA100引物组为最佳引物。

2.2 温度优化实验结果

图2 温度优化实验结果Fig.2 Results of temperature optimization experiment

由图2可知，温度在60～67 ℃时，都能发生LAMP扩增反应，但反应时间不同。63，64，65 ℃时发生LAMP反应时间较早，在18 min时分别为0.077，0.081，0.082，由于温度较高时特异性更好，所以将最佳温度选为65 ℃。

2.3 特异性实验结果

图3 特异性实验结果(浊度法)Fig.3 Results of specificity test (nephelometry)

由图3可知，罂粟1～12号样本都能发生LAMP反应，其他香辛料均不发生反应，体现了LAMP反应的特异性。虞美人LAMP扩增时间较晚，但也能发生扩增反应，分析原因，虞美人属于罂粟科罂粟属植物，所含成分与罂粟相近，所以也能发生反应。因为调味粉产品中不添加虞美人，因此不影响检测效果。

2.4 敏感性实验结果

图4 敏感性实验结果(浊度法)Fig.4 Results of sensitivity test (nephelometry)

图5 敏感性实验结果(染色法)Fig.5 Results of sensitivity test (staining method)

注：从左到右，模板浓度依次为70，7，0.7 ng/μL和70，7，0.7，0.07 pg/μL，阴性对照。

由图4和图5可知，将10倍梯度稀释的罂粟碱基因组模板用于LAMP 反应，浊度法与染色法实验结果一致，LAMP最低检测浓度为70 pg/μL。

图6 PCR敏感性的实验结果Fig.6 Results of sensitivity test for PCR

注：从左到右，模板浓度依次为70，7，0.7 ng/μL和70，7，0.7，0.07 pg/μL，阴性对照。DNA Marker 为D2000。

将10倍梯度稀释的基因组用于PCR反应，由图6可知， PCR最低检测浓度为0.7 ng/μL，因此LAMP法敏感性是普通PCR方法的10倍。

2.5 试剂盒验证实验结果

图7 试剂盒验证实验结果Fig.7 Results of detection test for seasoning powders

由图7可知，使用该试剂盒对市场上8种复合调味粉进行检测，其中一种调味粉(4号样本)显示阳性，即含有罂粟碱成分。采用国标法检测，符合率为100%。

3 结论

本研究对收集的12种罂粟、11种香辛料和1种虞美人，使用Takara试剂盒，采用 NanoQ微分光光度计测定DNA浓度，最终确定从罂粟种子中提取DNA，其含量最高。

根据罂粟碱靶基因序列，采用LAMP引物设计软件进行引物设计。NCBI网站序列对比显示：引物对罂粟基因具有特异性。因此，12种罂粟都发生LAMP扩增反应，11种香辛料均不发生扩增反应。因为虞美人属于罂粟科罂粟属，与罂粟基因相近，所以也能发生反应。但虞美人不含罂粟碱成分，在调味粉产品中不添加，因此，检测中虞美人呈阳性，对调味粉中罂粟碱的有效检测没有影响。

组装的试剂盒对市售8种复合调味粉进行掺假检测，有一种含有罂粟成分。罂粟碱毒性巨大，市售复合调味粉一定要经过检测，确定不含罂粟成分后方能入市，确保食品安全。

本研究建立的方法准确可靠，简便快速，有助于市场中对调味粉的监管。

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ConstructionofLAMPDetectionMethodforPapaverineinSeasoningPowdersandDevelopmentofKit

YANG Liu, CHEN Yu-fei, WANG Lei

(School of Food Engineering, Jilin Business and Technology College, Changchun 130507, China)

The LAMP detection method for papaverine in seasoning powders is constructed and the corresponding kit is developed.The primer is designed based on the specific genes sequence of papaverine.The specificity test, screening test for optimum temperature and sensitivity test of 12 poppies,11 spices and nucleic acid sample of a corn poppy are made.The kit is assembled based on the optimized reaction conditions, and 8 commercially seasoning powders are detected by using kit. The results are determined as follows:12 poppies and corn poppy show the specific reaction.The optimum temperature is 65 ℃ and the minimum detectable concentration is 70 pg/μL,the sensitivity is 10 times larger than that of PCR.There is papaverine in one of the 8 commercially seasoning powders.The detection method and development of kit have great significance for monitoring the adulteration of poppy powder in seasoning powders.

seasoning powders；papaverine；LAMP；nephelometry；fluorescence；kit

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.035

1000-9973(2017)12-0158-04

2017-08-01

吉林省医药产业发展引导资金项目(20150311097YY)

杨柳(1975-)，女，教授，研究方向：食品安全检测。