黄芪甲苷和羟基红花黄色素A配伍抗脑缺血再灌注损伤的协同作用及机制研究

许航 丁一 刘文星 刘天龙 文爱东

(第四军医大学西京医院药剂科，陕西 西安 710032)

·论著·

黄芪甲苷和羟基红花黄色素A配伍抗脑缺血再灌注损伤的协同作用及机制研究

许航 丁一 刘文星 刘天龙 文爱东*

(第四军医大学西京医院药剂科，陕西 西安 710032)

目的探讨黄芪甲苷(AST-IV)和羟基红花黄色素A(HSYA)配伍治疗大鼠脑缺血再灌注损伤作用及其机制。方法100只大鼠随机分为假手术组、模型组、AST-IV组、HSYA组、AST-IV和HSYA配伍组等5组，采用线栓法建立大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，再灌注72 h评分后处死；脑组织制片后采用苏木素-伊红(HE)染色，免疫组化检测血小板-内皮细胞粘附分子(CD31)表达；氧化炎症检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)指标。结果与模型组比较，各给药组均有疗效，AST-IV组、HSYA组、AST-IV和HSYA配伍组均能改善大鼠神经损伤并减轻脑缺血再灌注损伤，促进CD31表达，改善SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，降低TNF-α和IL-β水平，其中配伍组的治疗效果最为显著。结论AST-IV和HSYA配伍可以显著发挥协同抗脑损伤作用，其抗炎、抗氧化和促血管新生作用是潜在作用机制。

脑缺血再灌注; 黄芪甲苷; 羟基红花黄色素A

缺血性脑卒中是指血管阻塞引起脑缺血和缺氧损伤导致的脑功能障碍，具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高等特点，是威胁人类健康的重大疾病之一。近年来，缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease, ICVD)呈现出全球年轻化趋势，严重危害了人类的健康和生活，并且缺乏有效的治疗药物[1]，因此，缺血性脑损伤保护药物的研发已成为医药界的研究热点。国内外研究已经证实，中药及其药效物质在脑缺血性疾病治疗中发挥着越来越重要的作用[2]。中药配伍具有多组分多靶点的整合药效学优势，能够在抗炎、抗氧化、促血管生成等方面发挥协同增效作用[3-4]。黄芪与红花配伍使用常见于治疗气虚血瘀证的方剂，其中黄芪重在补气，红花旨在活血，二者配伍使用完全契合缺血性脑卒中气虚血瘀的病理机制[5]。前期研究以及本课题组的研究已经发现，黄芪甲苷(astragaloside IV, AST-IV)和羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A, HSYA)分别是黄芪和红花的主要药效活性成分。AST-IV是黄芪主要药效物质基础，可通过抗炎、促进血管新生等机制发挥脑缺血再灌注的保护作用[6-7]。HSYA是红花的药效物质，可在脑缺血后提升脑血流量，减小梗死面积，以及通过其抗氧化作用保护脑细胞免受缺血损伤[8-9]。然而，目前仅有AST-IV或HSYA单组或与其他少数中药有效成分配伍在治疗抗脑缺血再灌注损伤的研究，二者配伍在该方面的防治效果却鲜有报道。因此，本研究基于中医理论的多组分多靶点理念，基于大鼠脑缺血再灌注模型，通过苏木素-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色和免疫组化染色等方法，检测损伤后各组病理学改变、神经学功能评分和抗炎、抗氧化生化指标以及血小板-内皮细胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1, CD31)表达，探讨AST-IV和HSYA配伍抗脑缺血再灌注损伤及其机制，为该类组方的二次开发及其应用提供实验基础。

材料方法

一、材料

黄芪甲苷(批号A0070)和羟基红花黄色素A(批号78281)购自中国成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥95%，使用时以5%的羧甲基纤维素钠配成混悬液备用。SD雄性大鼠100只，体质量为250～300 g，由第四军医大学动物实验中心提供。

二、实验分组和给药

将100只大鼠随机分为假手术组、模型组、AST-IV组、HSYA组、AST-IV和HSYA配伍组，每组各20只。假手术组和模型组分别注射等剂量0.9%氯化钠注射液3 mL；AST-IV组给予40 mg/kg的AST-IV，用0.9%氯化钠注射液稀释至3 mL腹腔注射；HSYA组给予60 mg/kg的HSYA，用0.9%氯化钠注射液稀释至3 mL腹腔注射；配伍组给予混匀的20 mg/kg AST-IV和30 mg/kg HSYA，分别于手术前12 h和30 min注射1次，手术后每隔12 h再注射1次，直到72 h后最后1批大鼠被处死。各组剂量选择基于以往药效学实验研究[3, 10]。

三、动物模型建立

局灶性脑缺血再灌注模型鼠参照Zea Longa法进行制作。大鼠麻醉后，结扎翼腭动脉和颈外动脉，远心端用电凝器灼断。颈外动脉残端剪一切口，将线栓经左侧颈外动脉主干切口缓慢向颈内动脉入颅方向推进至大脑中动脉。阻断3 h后，拨出线栓至有轻微阻力时为止，完成脑缺血再灌注损伤模型。假手术组将线拴插入颈内动脉6 mm，模型组将线拴堵塞推进至大脑中动脉，阻断3 h后，拨出线栓至有轻微阻力时为止，完成脑缺血再灌注损伤模型。假手术组将线拴插入颈内动脉6 mm，模型组将线拴堵塞大脑中动脉，不加药物处理。标本分别于脑缺血2 h再灌注72 h各时间点用10%水合氯醛麻醉(0.35 mL/100 g)大鼠后获取。4%多聚甲醛灌注固定后断头取脑，切取冠状脑片，石蜡包埋及切片。纳入统计的大鼠为80只，损失包括制作脑缺血再灌注模型中不符合标准的12只大鼠和术中操作失误导致大出血死亡的8只大鼠。

四、神经功能学评分

按照Zea Longa评分标准，在术后72 h对各组大鼠按以下标准进行评分。0分为无神经损伤症状，1分为不能完全伸展对侧前爪，2分为向对侧转圈，3分为向对侧倾倒，4分为不能自发行走，意识丧失。

五、脑梗死面积计算

脑缺血24 h后处死大鼠，断头取脑，将大鼠脑组织置于脑磨具中，切成2 mm厚度，置于1%的氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride, TTC)染液，避光，37 ℃恒温箱中染色30 min，然后将完成染色的脑组织用4%的多聚甲醛置于4 ℃保存固定。用数码相机拍照后，用Image Pro Plus 7.0处理并计算脑梗死面积的百分比。

六、HE染色

采用HE染色观察大鼠脑缺血再灌注损伤后的病理变化。大鼠缺血再灌注72 h后经肝素生理盐水和4%的多聚甲醛灌注内固定后断头取脑，取视交叉向后3 mm脑块进行4%的多聚甲醛外固定，自动脱水机脱水，石蜡包埋及切片，将各组切片分成两组，一组进行常规HE染色，另一组进行免疫组化染色。

七、免疫组化检测CD31表达

采用链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex, SABC)方法对CD31表达进行检测。石蜡切片脱蜡至水；5%～10%正常山羊血清经磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline, PBS)稀释后封闭，室温孵育10 min。倾去血清，滴加1∶100比例稀释的一抗，阴性对照采用正常山羊血清替代一抗进行；4 ℃过夜。用PBS冲洗，5 min×3次。加1∶100比例的生物素标记二抗，37 ℃孵育10～30 min。用PBS冲洗，5 min×3次。加试剂SABC，37 ℃孵育10～30 min。再用PBS冲洗，5 min×3次。采用二氨基联苯氨(diaminobezidin, DAB)显色剂显色，苏木精复染2 min，冲洗10～15 min，然后进行酒精脱水、二甲苯浸泡透明、中性树胶封片和镜检。显微镜下计数每个视野阳性细胞数，平均每张切片取10个视野，并计算其平均值。

八、脑组织氧化和炎症指标

大鼠造模后72 h被处死，迅速取脑，在冰上分离右侧海马组织，-80 ℃保存，将组织用生理盐水匀浆后进行蛋白提取及浓度测定。利用谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, SOD)检测其氧化和抗氧化水平，利用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)测定其炎症和抗炎水平。按照各检测试剂盒的说明书进行操作，试剂盒购自南京建成生物工程公司。

九、统计学方法

结 果

一、神经学功能评分

再灌注72 h时，各给药组与模型组之间存在的差异具有统计学意义(P<0.05)。AST-IV和HSYA配伍组的评分显著高于AST-IV组和HSYA组，说明配伍组在神经功能作用改善方面优于单用组(P<0.05)，如图1A所示。

二、脑梗死面积变化

如图1B所示(红色为正常，白色为梗死灶)，假手术组没有出现梗死灶，而模型组脑组织出现大片白色梗死灶。与模型组比较，给药组的脑梗死灶面积明显减少，说明AST-IV和HSYA的药效物质对脑神经系统具有保护作用，可以减轻脑梗死面积，而且配伍组对脑梗死的缓解作用显著优于AST-IV组和HSYA组。

图1 各组模型动物72 h脑损伤评估情况
Fig 1 Evaluation of brain injury at 72 h in five groups
A:Neurological deficit scores at 72 h (Each "。" symbol refers to one rat and horizontal line means median); B:Infarct volume measurement at 72 h.
aP<0.05,vsmodel group;bP<0.05,vsAST-IV+HSYA group.

三、病理学形态变化

HE染色结果显示，模型组(B)细胞形态和结构与假手术组(A)相比出现异常，胞核固缩、深染，核仁不清楚。AST-IV组(C)和HSYA组(D)脑缺血再灌注72 h后，出现细胞形态和结构异常，胞体和胞核固缩和深染，核仁不清楚，细胞周间隙增大，但与模型组比较，损伤较轻。AST-IV和HSYA配伍组(E)脑缺血再灌注72 h后，与药物单用组(C、D)比较，细胞间隙缩小，细胞形态基本可辨，未出现大量神经元死亡，如图2所示。

四、氧化和炎症指标

实验结果表明，与假手术组比较，缺血再灌注组大鼠的SOD和GSH-Px活性显著降低，TNF-α和IL-1β浓度增加(P<0.05)；与缺血再灌注组比较，药物预处理组SOD和GSH-Px活性显著升高，TNF-α和IL-1β水平明显减少(P<0.05)；与两单用组进行分组比较，发现配伍组的SOD和GSH-Px活性均显著升高，而TNF-α和IL-1β水平明显减少(P<0.05)；如表1所示。

五、脑组织CD31的表达差异

免疫组化染色结果显示，各给药组缺血再灌注72 h时，CD31阳性细胞表达与模型组之间差异具有统计学意义(P<0.05)；再灌注72 h后，配伍组(E)与AST-IV组(C)和HSYA(D)组之间存在显著差异(P<0.05)，如图3所示。

GroupnSODU/mgGSH⁃PxU/mgTNF⁃αPg/mgIL⁃1βPg/mg Sham20153．5±11．473．1±7．47．6±1．315．5±1．2 Model1288．6±9．149．6±4．722．3±3．849．2±4．1 AST⁃IV16109．3±9．7ab69．8±7．5ab13．2±2．0ab31．6±3．8ab HSYA1497．9±13．5ab62．4±6．9ab14．7±2．7ab27．6±2．2ab AST⁃IV+HSYA18112．3±10．6a74．1±12．1a9．4±2．1a19．1±3．4a

aP<0.05,vsmodel group;bP<0.05,vsAST-IV+HSYA group.

图2 脑皮层梗死区HE染色结果(×400)
Fig 2 The cerebral cortex infarction by HE staining (×400)
A:No histopathological abnormalities were observed in sham group; B:Most neurons in the damaged area in model group appeared shrunken and unclear; C, D:Decreased cell swelling and pyknotic nuclei took place in both AST-IV and HSYA groups; E:The most apparent reduction of cell swelling and pyknotic nuclei was observed in AST-IV+HSYA group.

图3 脑皮层梗死区免疫组化染色CD31表达结果(×400)
Fig 3 The CD31 expression in the cerebral cortex infarction by immunohistochemical staining (×400)
A:Many CD31-positive cells were observed in sham group; B:Decreased number of CD31-positive cells was observed in model group; C, D:Increased number of CD31-positive cells was observed in both AST-IV group and HSYA group compared with model group; E:CD31-positive cells in AST-IV+HSYA group outnumbered that in both AST-IV group and HSYA group.

讨 论

脑血管疾病是造成人类死亡的三大疾病之一，其中缺血性脑血管病占很大比例。脑缺血后神经元能量衰竭、坏死，并出现炎症反应[11]。再灌注引起大量的活性氧自由基释放，同时刺激缺血区的炎症细胞分泌多种炎性介质，导致更多细胞损伤[12]。缺血性脑血管病在中医学属于中风，活血化瘀的中药可以通过改善抗炎和清除氧自由基促进血管生成从而改善脑组织代谢，促进神经功能的恢复[13]。

自从张伯礼院士等学者提出“以组分配伍来研制现代中药”以来，中药组分配伍不仅受到中医药学界的关注，而且成为目前方剂配伍研究的热点。中药组分配伍针对应用广泛、疗效显著的中药或方剂进行深入研究，在药效成分和作用机制比较明确的前提下，选取中药的有效部位或有效成分，运用现代药理技术对配伍组分进行优化筛选，最终获得具有最佳治疗效果的组成和配比。AST-IV和HSYA均对大鼠脑缺血再灌注损伤产生保护作用，两者主要作用机制虽有重叠，但在抗炎、抗氧化、促进血管新生的相关靶通路存在差异，因此我们对两组分单用及配伍抗脑缺血再灌注的作用进行了对比研究。

本研究发现，各给药组大鼠的脑梗死面积比模型组明显缩小，治疗前后神经功能缺失评分变化与模型组相比差异显著；皮质区的病理变化与模型组相比损伤较小，该结果与前期对AST-IV和HSYA两种单体的诸多药效学研究结果完全一致，而且药物配伍组比单用组的疗效更为显著。此外，我们进一步从抗氧化、抗炎、促进血管新生三个方面对抗脑缺血损伤的药效物质从单用和配伍进行了对比分析。SOD和GSH-Px作为生物体内清除自由基的主要酶系[14]，其活性的高低反映了生物体自身清除氧自由基的能力。TNF-α和IL-1β是众多细胞因子的重要启动因子，也是参与脑缺血再灌注损伤的重要炎症细胞因子之一，可以作为脑缺血损伤炎症标志物。研究结果表明，配伍组在抗氧化和抗炎指标改善方面比单用组更为显著。细胞表面抗原CD31是很多造血祖细胞共有的细胞表面蛋白，当缺血性脑卒中发生时，CD31+细胞进入外周循环后归巢至损伤区域，促进血管新生[15]，因此，外周血液及损伤组织中的CD31+细胞水平可以作为评估组织修复程度的指标。实验发现，与单用组相比，配伍组可以显著增加CD31表达，说明其在脑缺血后促进血管新生方面能够发挥协同增效的作用。

综上所述，AST-IV和HSYA配伍组在大鼠脑缺血再灌注模型中对脑缺血再灌注损伤的治疗作用明显优于AST-IV治疗组和HSYA治疗组，其协同机制与抗炎、抗氧化、促进血管新生密切相关，证明了两药效物质在改善脑卒中血瘀证方面存在“相须”和“相使”作用。虽然AST-IV和HSYA配伍对脑缺血再灌注损伤的治疗作用机制有待进一步研究，但是本研究为黄芪红花配伍治疗缺血性脑血管病提供了新思路，为中药大品种二次优化升级提供了实验依据。

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ThesynergisticeffectsandmechanismofastragalosideIVandhydroxysaffloryellowAagainstcerebralischemiareperfusion

XUHang,DINGYi,LIUWenxing,LIUTianlong,WENAidong

DepartmentofPharmacy,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe effects and mechanism of astragaloside IV (AST-IV) and hydroxysafflor yellow A (HSYA) in combination against cerebral ischemia reperfusion in rats were studied.MethodsOne hundred Sprague Dawley rats were randomly divided into sham group, model group, AST-IV group, HSYA group and AST-IV+HSYA group. The model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) was established by thread ligation. Neurological system symptoms were evaluated at 72 h after ischemia reperfusion. The histopathological changes of brain tissues were stained with hematoxylin and eosin (HE) and the platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31) expression was detected via immunohistochemistry. The markers of oxidation and inflammation including superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) were examined.ResultsThe symptoms of neurological injury in treatment groups were improved significantly compared with those in model group. The expressions of CD31 were increased, the activities of SOD and glutathione peroxidase (GSH-Px) were improved, and the levels of TNF-α and IL-1β were decreased. Moreover, the most remarkable effect of treatment occurred in AST-IV and HSYA combination group.ConclusionAST-IV and HSYA in combination can exhibit obvious synergistic protective effects on ischemia reperfusion injury in rats, which is related to anti-inflammation, anti-oxidation and angiogenesis pathway.

Cerebral ischemia reperfusion; Astragaloside IV; Hydroxysafflor yellow A

1671-2897(2017)16-427-05

R 651

A

国家自然科学基金资助项目(81373947)

许航，硕士研究生，E-mail:xuhang@fmmu.edu.cn

*通讯作者： 文爱东，教授、主任药师，博士生导师，E-mail:adwen-2004@hotmail.com

2017-06-01；

2017-07-25)