长链非编码RNA MEG3在胶质瘤细胞U87中生物功能的研究

朱峰 张鹏 宋建荣 吕新文 周小龙 蔡珂 张超 何蓓 梁媛

(宝鸡市中心医院神经外科，陕西 宝鸡 721008)

·论著·

长链非编码RNA MEG3在胶质瘤细胞U87中生物功能的研究

朱峰 张鹏*宋建荣 吕新文 周小龙 蔡珂 张超 何蓓 梁媛

(宝鸡市中心医院神经外科，陕西 宝鸡 721008)

目的探讨长链非编码RNA 母系印记基因3(MEG3)在神经胶质瘤中的表达及对U87 胶质瘤细胞生物学功能的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测116例新鲜神经胶质瘤组织标本及癌周正常组织标本中长链非编码RNA MEG3的表达；MEG3 过表达后，分别采用四氮唑蓝盐化合物(MTS)法、流式细胞仪和Transwell 实验检测其对神经胶质瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响。结果MEG3在神经胶质瘤组织中的表达显著低于正常组织(4.85±0.56vs9.18±0.45;t=1.67,P=0.0012<0.05)；过表达MEG3后胶质瘤细胞U87增殖能力显著降低，差异具有统计学意义(62.0%±3.8%vs84.0%±4.6%;t=1.54,P=0.0145<0.05)；过表达MEG3后，细胞凋亡能力明显下降，差异具有统计学意义(19.4%±3.2%vs5.5%±1.2%;t=2.35,P=0.0013<0.05)；过表达MEG3后，U87细胞迁移能力显著下降，差异具有统计学意义(55.6%±5.8%vs100%±0;t=1.48,P=0.0021<0.05)。结论MEG3在神经胶质瘤中是低表达的，具有抑制细胞U87增殖和迁移，促进凋亡的作用，在神经胶质瘤的治疗中具有潜在的应用价值。

长链非编码RNA; 母系印记基因3; 神经胶质瘤; U87细胞; 生物学功能

长链非编码 RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是近年来发现的一类新型的转录物，长度一般超过200 nt，其不具有编码蛋白质的功能但能够通过调节mRNA 剪切、降解和翻译等生理过程发挥作用[1]。LncRNA也逐渐被认为是肿瘤相关的生物分子，可以作为肿瘤新的诊断靶标[2]。长链非编码RNA母系印记基因3-MEG3(maternally expressed gene 3)位于染色体14q32上，与肿瘤的发生进展相关。许多研究报道MEG3在如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胆囊癌、结直肠癌、肝癌、宫颈癌等多种肿瘤中存在异常表达，并且与肿瘤的发生进展以及侵袭、迁移相关[3]。但MEG3 在神经胶质瘤患者中的表达情况以及生物学功能还是未知的，因此，本文旨在研究MEG3在神经胶质瘤中的表达及其在U87细胞中的生物学功能。

材料与方法

一、标本收集

收集从2013年9月至2015年9月经我院确诊的116例神经胶质瘤组织及癌旁周正常组织作为对照。所有标本取完后立即保存在液氮中备用。来源于不同年龄段的神经胶质瘤患者年龄28～64岁，平均(49.7±4.6)岁；根据WHO分级，Ⅰ级纤维性星形细胞瘤25例，Ⅱ级弥漫性星形细胞瘤21例，Ⅲ级间变星形细胞瘤38例，Ⅳ级恶性胶质瘤32例。所有患者手术前均未接受化疗或放疗。所有患者都签署了知情同意书。

二、试剂和耗材

RNA提取试剂Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Houston, TX, USA)，Prime-Script逆转录-PCR 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)试剂盒(NCodeTMSYBR®Green miRNA quantitative real-time PCR)以及转染试剂Lipofectine 2000购自Invitrogen公司；Premix EX Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，ABl7300荧光定量聚合酶链反应PCR仪购自ABI公司。U87细胞系购自上海中科院生命科学研究所细胞库；Transwell小室购自美国BD公司；培养基，MTTMTS检测试剂购自Thermofisher公司。

三、RNA 提取、cDNA 逆转录及实时荧光定量聚合酶链反应

组织先用Qiagen公司的组织破碎仪进行破碎后提取癌组织和正常组织的总mRNA。总mRNA提取按照Trizol®RNA 提取试剂操作说明进行，Nanodrop测定总mRNA的含量和浓度，所有RNA测量吸光度(A)值，保证RNA的完整性(A260/A280>2.0)。总mRNA按照Invitrogen公司逆转录试剂盒操作说明逆转录成MEG3 以及内参甘油醛磷酸脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)的cDNA。用SYBR Green试剂盒进行实时荧光定量聚合酶链反应扩增，反应体系：1 μL cDNA (500 ng/20 μL)，0.6 μL primer (10 pmol/L)，9 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，无RNase水8.4 μL。反应条件：95 ℃ 2 min 预热，95 ℃ 15 s变性，55 ℃ 30 s退火，68 ℃ 30 s延伸，40个循环。引物序列，MEG3：正向引物5'-CTGCCCATCTACACCTCACG-3'，反向引物5'-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGG GGCT-3'；GAPDH：正向引物5'-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3'，反向引物5'-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。

四、细胞培养

U87细胞用高糖改良Eagle培养基(Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)(含10% 胎牛血清和1%双抗)培养基于37 ℃、5% CO2Thermofisher恒温培养箱中进行培养，根据细胞培养情况每2～3 d进行传代，取对数生长期细胞进行后续实验。用Lipofectine 2000进行转染pcDNA-MEG3。

五、MTS 法检测转染后U87细胞增殖

将转染后细胞胰酶消化后制成单细胞悬液，细胞密度为3000个/mL，每孔100 μL 接种于96孔板中，放置恒温培养箱中培养，分别培养24、48、72、96 h后每孔加入20 μL MTS，酶标仪检测吸光度，统计细胞生存活率。每组实验重复3次。

六、流式细胞检测转染后U87细胞凋亡

按照BD公司细胞凋亡检测试剂盒上的操作说明进行实验。用不含乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt, EDTA)的胰酶消化收集转染48 h后的各组细胞，1000 r/min 离心 5 min，弃上清，用预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS) 洗涤 1 次，加入200 μL结合缓冲液，再加入异硫氰酸荧光素和碘化丙碇各5 μL轻轻混匀，避光室温孵育15 min，尼龙莫过滤到流式管中后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

七、Transwell检测U87细胞迁移

取转染后48 h的U87胶质瘤细胞，胰酶消化处理后，用无血清的培养基进行重悬，制备单细胞悬液，细胞计数后，再用无血清培养基调整细胞浓度为1.5×105个/mL，将200 μL各组细胞悬液移入transwell小室内，每组3个重复，再将Transwell小室植入24孔板内，然后在Transwell小室下层孔中加入600 μL含有10%胎牛血清的 DMEM 培养基，培养箱孵育36 h，取出小室，用干净棉签擦去上室面细胞，4%多聚甲醛室温固定30 min，置于0.1% 结晶紫染色液中20 min，高倍显微镜下随机选择 5个视野计算每个视野平均穿膜细胞数。

八、统计学处理

结 果

一、MEG3在神经胶质瘤中显著性低表达

我们对MEG3在116例神经胶质瘤组织和相对应的癌旁正常组织中的表达情况进行qRT-PCR定量分析，结果如图1所示。与正常组织相比，MEG3在神经胶质瘤中显著性低表达(4.85±0.56vs9.18±0.45;P=0.0012)。

图1 MEG3在神经胶质瘤和癌旁正常组织中的差异表达
Fig 1 The expression level of MEG3 in glioma
aP<0.05,vscontrol group.

图2 LncRNA MEG3过表达对U87细胞增殖的影响
Fig 2 The effect of overexpression of LncRNA MEG3 on U87 cell
aP<0.05,vscontrol group.

二、LncRNA MEG3过表达抑制神经胶质瘤细胞U87增殖

为进一步研究MEG3在神经胶质瘤细胞中对增殖的影响，我们通过对过表达MEG3的U87细胞和正常U87细胞进行MTS检测，发现MEG3过表达后显著降低细胞增殖(84.0%±4.6%vs62.0%±3.8%;t=1.54,P=0.0145<0.05)，而且随着时间增加，抑制能力显著增强。如图2 所示。

三、LncRNA MEG3过表达抑制神经胶质瘤细胞U87凋亡

为研究MEG3在神经胶质瘤细胞中对凋亡的影响，我们通过对过表达MEG3的U87细胞和正常U87细胞进行过流式凋亡检测，发现MEG3过表达后细胞凋亡为19.4%±3.2%，而对照组为5.5%±1.2%，两组之间差异显著(t=2.35,P=0.0013<0.05)，表明MEG3具有促进细胞凋亡的作用。如图3所示。

图3 LncRNA MEG3过表达对U87细胞凋亡的影响
Fig 3 The effect of overexpression of LncRNA MEG3 on U87 cell apoptosis
A:The flow cytometry apoptosis of control group; B:The flow cytometry apoptosis of MEG3 overexpression group; C:The statistical graph of apoptosis.
aP<0.05,vscontrol group.

四、LncRNA MEG3过表达抑制神经胶质瘤细胞U87迁移

为研究MEG3在神经胶质瘤细胞中对迁移的影响，我们通过对过表达MEG3的U87细胞和正常U87细胞进行Transwell实验，发现MEG3过表达后细胞相对与正常对照组的迁移率为55.6%±5.8%，两组之间差异显著(55.6%±5.8%vs100%±0;t=1.48,P=0.0021<0.05)，从而表明MEG3具有抑制细胞迁移的作用。如图4所示。

图4 LncRNA MEG3过表达对U87细胞迁移的影响
Fig 4 The effect of overexpression of LncRNA MEG3 on U87 cell migration
aP<0.05,vscontrol group.

讨 论

神经胶质瘤是最常见的原发性恶性脑瘤，占颅内肿瘤发病率首位[4]。世界卫生组织(World Health Organization, WHO)根据病理组织恶性程度将原发神经胶质瘤分为四个等级，Ⅰ～Ⅱ级是低等级胶质瘤，Ⅲ～Ⅳ级是高等级胶质瘤[5]。高等级胶质瘤1年总体生存率为40%，5年生存率不足10%，而且在中国近几年发病率有逐渐上升的趋势，因此迫切需要新的治疗方法和新型肿瘤标记物用于神经胶质瘤的诊断以及治疗[6]。

随着全基因组测序技术的发展，发现具有转录和编码蛋白功能的RNA仅占基因组转录产物的2%，而其余98%的RNA不具备蛋白编码功能[7]。这些非编码RNA中长链非编码LncRNA长度在200个核苷酸以上，不具有编码功能。研究发现，LncRNA表达水平在不同发育阶段存在差异，并且具有组织特异性；相当一部分LncRNA表达失调与人类恶性肿瘤的发生与进展密切相关，可作为肿瘤的生物标记物和预后因子[2,8]。

最近的研究已经表明通过LncRNA表达分析谱的筛选发现神经胶质瘤中LncRNA的表达发生显著性改变[9]。LncRNA MALAT1与神经胶质瘤的生长、转移和不良预后相关；而且MALAT1表达下调可以抑制胶质瘤细胞的克隆形成、周期阻滞以及体内肿瘤生长[10]。LncRNA GAS5、HOTAIR、H19等在胶质瘤中可通过调控miRNA影响胶质瘤细胞生长[11]。但是还没有研究报道MEG3在神经胶质瘤中的表达和生物学功能。

母系印记基因MEG3(maternally expressed gene 3)属于长链非编码RNA，作为第一个被证明具有抑癌基因功能的LncRNA，其抑癌基因的功能非常复杂而且在不同类型肿瘤中参与不同的信号通路，比如MEG3可通过p53 激活影响非小细胞肺癌和胰腺癌的生长和凋亡，而且MEG3低表达患者预后均不良[12]；在胆囊癌和前列腺癌中，MEG3可以通过ERK/MAPK通路的激活抑制肿瘤细胞的增殖和促进凋亡[13]；在子宫颈癌中，MEG3可调控miR-21影响子宫颈癌细胞的生长[14]。同时也有研究报道了MEG3在不同肿瘤中的临床意义，比如在肾细胞癌中MEG3高表达与肿瘤分期、转移、短生存时间紧密相关[13]；血液中的MEG3也可作为非小细胞肺癌诊断的新型生物标记物；MEG3在肿瘤组织中的表达也与胰腺癌、结肠癌、子宫颈癌的临床进展、不利预后相关[2]。但MEG3在子神经胶质瘤中的临床作用和意义，现在还没有相关报道。

在本研究中，我们首先研究了MEG3在神经胶质瘤中的表达情况，通过实时荧光定量qRT-PCR检测了MEG3在神经胶质瘤及其对应癌旁组织中的mRNA表达水平，结果分析表明，MEG3在癌组织中低表达，和癌旁正常组织相比差异有统计学意义(4.85±0.56vs9.18±0.45;P=0.0012<0.05)。预示MEG3在神经胶质瘤的发生发展中可能发挥非常重要的作用。

进一步研究MEG3在神经胶质瘤中的生物学行为，通过对U87神经胶质瘤细胞过表达MEG3，然后检测MEG3在增殖，凋亡和迁移中的作用。通过实验发现MEG3过表达后胶质瘤细胞U87增殖能力显著降低，差异具有统计学意义(62.0%±3.8%vs84.0%±4.6%;t=1.54,P=0.0145<0.05)；过表达MEG3后，细胞凋亡能力明显下降，差异具有统计学意义(19.4%±3.2%vs5.5%±1.2%;t=2.35,P=0.0013<0.05)；过表达MEG3后，U87细胞迁移能力显著下降，差异具有统计学意义(55.6%±5.8%vs100%±0;t=1.48,P=0.0021<0.05)。

但本研究并未进一步对MEG3表达与神经胶质瘤患者临床病理特征的相关性进行分析，同时MEG3在胶质瘤诊断中价值以及生存预后分析还需要进一步研究。

总之，本研究表明LncRNA MEG3在神经胶质瘤中是低表达的，且在神经胶质瘤的治疗中具有潜在的应用价值。

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ExpressionandbiologicalfunctionofLncRNAMEG3inglioma

ZHUFeng,ZHANGPeng,SONGJianrong,LVXinwen,ZHOUXiaolong,CAIKe,ZHANGChao,HEBei,LIANGYuan

1DepartmentofNeurosurgery,CentralHospitalofBaoji,Baoji721008, China

ObjectiveThe expression and biological functions of LncRNA maternally expressed gene 3 (MEG3) in glioma were investigated.MethodsReal-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect lncRNA MEG3 expression of 116 cases of glioma and adjacent normal brain tissues. And MTS [3-(4, 5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium, inner salt] assay, flow cytometry and Transwell assay were further used to analyze the proliferation, apoptosis, and migration of MEG3 overexpression.ResultsLncRNA MEG3 expression was significantly decreased in the glioma compared with the normal tissues (4.85±0.56vs9.18±0.45;t=1.67,P=0.0012<0.05); overexpression of MEG3 inhibited the cell proliferation (62.0%±3.8%vs84.0%±4.6%;t=1.54,P=0.0145<0.05), promoted the cell apoptosis (19.4%±3.2%vs5.5%±1.2%;t=2.35,P=0.0013<0.05) and inhibited the cell migration (55.6%±5.8%vs100%±0;t=1.48,P=0.0021<0.05) in U87 human glioma cell line.ConclusionLncRNA MEG3 is lowly expressed and indicates the inhibition of proliferation and migration and promotion of apoptosis in glioma and implicates the potential application of MEG3 in glioma therapy.

LncRNA; MEG3; Glioma; U87 cell; Biological function

1671-2897(2017)16-422-05

R 739

A

朱峰，主治医师，E-mail:zhufeng198102@163.com

*通讯作者： 张鹏，主任医师，E-mail:longniao20000@sina.com.cn

2016-11-11；

2017-02-25)