一种基于多底物混合共代谢定向产酸发酵研究

李春颖，李晓燕

(哈尔滨商业大学 能源建筑与工程学院，哈尔滨 150028)

一种基于多底物混合共代谢定向产酸发酵研究

李春颖，李晓燕

(哈尔滨商业大学 能源建筑与工程学院，哈尔滨 150028)

以牛粪、水稻秸秆、糖蜜废水的三种底物混合共代谢发酵作为CSTR的产酸相，联合IC产甲烷相进行两相厌氧发酵，其中研究的重点是提高产酸相的产酸量.通过pH值、ORP值、VFAs、TOC、TN、可溶性COD质量浓度的测定以及红外光谱(FTIR)观察水稻秸秆的降解情况.通过PCR-DGGE来观察产酸相优势种群的变化，来调节最适共代谢发酵底物，以进入产甲烷相来提高产甲烷量.结果表明，厌氧CSTR反应器发酵前30 d，反应器内pH值、ORP值均呈下降趋势，此后，反应器内pH值比较稳定，在6.2～6.5之间上下浮动，ORP值在-250～-400 mV之间浮动.反应器运行30 d，TOC、TN含量大量增加，可溶COD质量浓度上升.反应60 d时，仍能满足C/N比为27∶1，此时TOC、TN、可溶COD质量浓度含量趋于稳定，进入共代谢产酸发酵的稳定期.乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的含量均随着时间的变化先增加后下降.随着反应进行60 d，丙酸迅速下降，没有出现酸积累现象，反应器内以乙酸为主.通过FTIR观察，发现水稻秸秆得到有效的降解.本文利用PCR-DGGE技术解析产酸相，以Clostridium bifermentans、Firmicutes bacterium、Pseudomonas aeruginosa为优势菌群.

多底物；共代谢；混合发酵；PCR-DGGE

我国是农业大国，目前世界上农业废弃物产出量最大，每年大约有40多亿t，其中畜禽粪便排放量26.1亿t，农作物秸秆7.0亿t[1].虽然我国拥有大量的农业废弃物，但却没有被充分利用，大部分的秸秆都选择了直接焚烧处理，畜禽粪便处理直接采用自然堆沤或者作为肥料和饲料使用.然而焚烧秸秆释放了大量的气体并且严重污染环境，造成的资源的严重浪费.畜禽粪便直接作为肥料使用，会使寄生虫、病菌等微生物大量传播，这就会导致大量流行病的传播，给人类带来危害.糖蜜，作为糖类生产中的副产物，常用作工艺发酵生产的原材料，如用于乙醇和酵母生产.然而，1 L乙醇的生产需要消耗13～15 L的糖蜜，因此产生了大量的糖蜜废水[2].目前在国内外学者的研究中，牛粪作为最主要的混合发酵底物，将牛粪与秸秆、生活垃圾、餐厨垃圾和各种废水混合共代谢发酵已成为厌氧发酵的新趋势.这项新技术不仅可能降低污染率而且还将农业废弃物合理资源化利用.刘心雨[3]等利用发酵TS质量浓度20%条件下，50%玉米秸秆和50%牛粪配比与纯牛粪两种原料进行沼气发酵，实验表明，混合发酵原料产沼气量明显高于纯牛粪，并且恒温35 ℃发酵的产气量明显高于常温发酵.Kanokwan Boe等[4]将糖蜜废水与牛粪进行混合共代谢发酵，实验表明，当牛粪与5%糖蜜废水配比进行混合时，最大产甲烷量为300 mLCH4/gVS.但当牛粪与高于15%糖蜜进行混合时，产气会受到抑制.

本文选取牛粪、水稻秸秆、糖蜜废水三种廉价废弃物作为共代谢发酵底物，采用两相工艺(CSTR-IC)，重要研究CSTR反应器内进行厌氧水解酸化发酵，考察发酵过程中pH值、ORP、挥发性脂肪酸等指标，并分析研究产酸相中秸秆降解情况，为产酸相共代谢发酵液作为发酵底物进入IC产甲烷相提供依据.

1 材料与方法

1.1实验材料

试验中所用发酵底物水稻秸秆于2016年9月取自黑龙江省阿城县，试样采集后摊放于实验室内自然风干，风干后的水稻秸秆用粉碎机粉碎为粉末；牛粪取自黑龙江省肇东市养殖场；糖蜜废水取自黑龙江省肇源市食品公司利用甜菜糖蜜发酵进行酵母生产时产生的酵母糖蜜废水.

1.2底物参数

产酸发酵共代谢底物的基本特性见表1.产气量实验条件为发酵温度为35 ℃，发酵时间为粪便60 d，秸秆90 d.

表1用于产酸发酵的共代谢底物的基本特性

底物含水量/%总固体/%挥发性固体/%C/N粗蛋白/%粗纤维/%粗脂肪/%产气量/(m3·kg-1)干稻草秸秆17838467∶12314.78.20.4牛粪83177425∶112.736.72.50.3糖蜜废水4555—7∶1200.20.4—

1.3试验方法和装置

本试验在中温35 ℃下采用CSTR-IC两相厌氧发酵工艺，左侧CSTR反应器总体积为10 L，IC反应器总体积为3.4 L，高径比为5∶1，装置结构如图1所示，本文研究的重点是产酸相.

在CSTR产酸相反应器中接入牛粪、水稻秸秆、糖蜜废水三种发酵底物，其中加入牛粪3 700 g，水稻秸秆126 g，糖蜜废水150 mL，加入水混合共8 L，满足8%的料液质量浓度，C∶N=27∶1.稳定运行4个月.IC反应器中接入取自黑龙江省肇东市中温批次混合发酵沼气池内的沼液，富含大量产甲烷菌.本实验旨在调控CSTR产酸相中各项工艺参数，使底物利于IC相高效产甲烷.

图1 CSTR-IC两相厌氧发酵系统1—蠕动泵；2—集气罐；3—搅拌器；4—pH计；5—预处理池；6—进料泵；7～9—取样口；10—出气口；11—二级三相分离器；12—一级三相分离器；13～19—取样口

1.4指标测试和分析

CSTR产酸相反应器运行后，实时监测反应器内pH值、ORP值、挥发性脂肪酸(VFAs)、可溶COD值、总有机碳(TOC)、总氮(TN)等指标并定期取样.同时，采用红外技术(FTIR)观察不同时期秸秆的降解程度；运用分子生物学手段对产酸相不同时期优势种群进行分子鉴定.通过测定这些指标判断产酸相末端代谢产物，并通过调节HRT、OLR等工艺运行参数，对产酸相进行生理生态因子调控，使底物利于定向高效产甲烷转化.

pH值、ORP值使用pH计进行测定；可溶COD值使用快速COD测定仪进行测定；挥发性脂肪酸(VFAs)、总有机碳(TOC)、总氮(TN)采用下述方法测定.

1)挥发性脂肪酸(VFAs)的测定

取一定体积发酵液样品，于12 000 rad/s条件下离心10 min，取液体样品1 mL，加入内标物乙酸丁酯，用带自动进样器的Agilent 7890GC-FID气相色谱仪测定挥发酸的含量及成分.

操作条件：前进样器尺寸10 μL，进样体积1 μL；分流比20∶1，进样口温度250 ℃，进样压力3.7683 psi；色谱柱：Agilent INWax: 250 ℃，30 m ×530 μm ×1 μm； 程序升温70 ℃ 保持0.646 67 min，然后以25 ℃/min升至170 ℃；检测器温度300 ℃，H2流速45 mL/min，空气流速 450 mL/min，载气为N2，流速40 mL/min.

2)总有机碳(TOC)、总氮(TN)的测定

取一定体积发酵液样品稀释250倍，于12 000 rad/s条件下离心10 min，采用日本岛津总有机碳/总氮分析仪TOC-VCPN进行分析.

3)傅里叶红外(FTIR)观察水稻秸秆组分变化

取各时期厌氧干发酵反应器内水稻秸秆固形物，研磨后放入玛瑙研钵中，加入KBr晶体，混匀磨细，取少许混合样品压片后在FTIR 光谱仪上进行测定.

4)PCR-DGGE观察产酸相不同时期优势种群的变化

取不同预处理时期的溶液离心，取沉淀物提取细菌总基因组DNA，运用PCR技术进行扩增，再通过变性梯度浓胶电泳(DGGE)对各优势菌群进行区分，通过序列分析与绘制系统进化树对共代谢混合发酵后产酸相菌群特性进行比对分析.

2 结果与讨论

2.1 CSTR产酸相反应器内pH、ORP值的变化

厌氧CSTR反应器内pH值、ORP值的变化将会直接厌氧反应器内微生物种群变化及反应器的运行效能.本实验中对反应器不同时期CSTR产酸相中pH、ORP值进行测定. 如图2所示，在厌氧发酵前30 d，反应器内pH、ORP值均呈下降趋势.这是因为经过一段时间的水解酸化，在产氢产乙酸菌的作用下，发酵原料中部分高分子化合物被分解为低分子化合物，反应产生了一些有机酸及挥发性脂肪酸所致.

图2 不同时期CSTR产酸相pH、ORP值变化

在经过大约30d的厌氧发酵后，产酸相反应器内pH比较稳定，在6.2～6.5之间上下浮动，ORP值在-250～-400 mV之间浮动.一般认为，产酸细菌最适pH值为6.0～7.0，两相厌氧消化系统则将产酸相的ORP值控制在-100～-300 mV 之间[5]，而产甲烷菌的最适氧化还原电位为-150～-400 mV[6]，因此，可见反应器内为产酸菌提供了合适的生存条件.

2.2 CSTR产酸相反应器内TOC、TN质量浓度及可溶COD质量浓度的变化

当反应器运行30 d，TOC、TN大量增加，可溶COD质量浓度上升.这说明运行初期，水稻秸秆中纤维素类物质已经开始逐步降解，产酸菌并未得到充分的生长繁殖，此时牛粪、糖蜜废水中大量的有机质如糖类、蛋白质类物质降解，产生大量的有机酸，故反应器内碳源、氮源增多.到40 d左右，TOC、TN、可溶COD又急剧下降，这是因为适宜的环境条件使得产酸菌大量繁殖，碳源、氮源得到充分利用.到反应的60 d，TOC、TN、可溶COD质量浓度趋于稳定，由此可以推断这一时期已进入共代谢产酸发酵的稳定期.见图3.

图3 不同时期CSTR产酸相TOC、TN质量浓度及可溶COD质量浓度变化

2.3 CSTR产酸相挥发酸(VFAs)质量浓度的变化

如图4所示，乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、乙醇的量均随着时间的变化先增加后下降.反应器运行初期，pH值、ORP值降低的阶段是挥发酸升高的阶段，前80 d，乙酸、丁酸、戊酸、乙醇均属于增加阶段.后期60 d，丙酸质量浓度迅速下降，说明产酸相中没有酸积累的现象.各类挥发酸质量浓度变化规律可以看出，随着混合发酵过程的进行，CSTR产酸发酵反应器内以乙酸为主.这为CSTR产酸发酵反应器发酵液进入IC产甲烷相提供了重要的参考依据.

图4 不同时期CSTR产酸相VFAs质量浓度变化

2.4 CSTR产酸相水稻秸秆成分的变化

研究采用红外光谱(FTIR)在波数4 000～400 cm-1范围内测定水稻秸秆中组分的变化.如图5所示，在共代谢发酵90 d后，3 399 cm-1附近的吸收峰明显减弱，此处为分子间氢键O-H伸缩振动，表明秸秆中以氢键连接的纤维素得到降解.底物共代谢发酵120 d期间，2 920 cm-1和2 851.5 cm-1的吸收峰相对强度已经明显增强.Stark N·M[7]等在利用FITR研究风化木塑复合材料表面时指出2 920 cm-1的吸收峰为-CH2-官能团的C-H伸缩振动，2 851.5 cm-1的吸收峰与-CH3的C-H相关，此时，2 920 cm-1和2 851.5 cm-1的吸收峰强度的增加表明共代谢发酵后木质素并没有得到降解，反而增加.Komilis D·P[8]等同样在利用固体废弃物厌氧分解对木质素和糖类的影响中指出木质素需要在分子氧存在的条件下才能分解，在厌氧条件下基本上不能达到分解的目的.897cm-1是纤维素的β-D-葡萄糖苷特征峰，共代谢发酵60 d后，该峰明显减弱，表明发酵处理后纤维素含量减少.832 cm-1为-CO32-的变角振动，共代谢发酵60 d后，该吸收峰相对强度明显增强，表明经过共代谢发酵后，生成了一些碳酸盐类物质，混合共代谢发酵促使了碳酸盐类的生成.该阶段乙酸、丁酸、戊酸明显增加.

图5 不同时期CSTR产酸相水稻秸秆成分的变化

共代谢混合发酵不仅可以在几个月内实现秸秆的快速降解，促使碳酸盐的生成，为产甲烷相提供适宜的发酵底物.同时也能使水稻秸秆、牛粪和糖蜜废水这三种废弃物实现资源化利用.

2.5 PCR-DGGE观察产酸相不同时期优势种群的变化

通过对CSTR产酸相不同阶段样品进行群落结构解析，以确定各阶段的优势菌群.取发酵原始液样品为1#，发酵8 d样品为2#，发酵26 d样品为3#.由图6所示，产酸相样品微生物种类比较丰富，1#、2#、3#泳道条带无明显差异，可见共代谢发酵底物为CSTR产酸发酵提供了适宜的环境，微生物能够很好的生长，优势菌群稳定存在于系统中.

图6 CSTR产酸相不同时期DGGE图谱

对图6中优势条带进行扩增，通过pMD-18载体与PCR回收产物进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中进行克隆，通过蓝白斑筛选挑取10白色单菌落进行PCR鉴定，随机挑选1～3个阳性克隆进行测序[9].将测序结果提交NCBI数据库，进行BLAST比对，选取同源性最高的序列运用MEGA5软件构建系统进化树，CSTR产酸相不同阶段DGGE图谱系统进化树如图7所示.

如图6所示，CSTR产酸相中出现了丰富的微生物群落，DGGE图谱中优势条带所指示的菌属有假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、盐水球菌属(Salinicoccus sp.)、双酶梭状芽孢杆菌(Clostridium bifermentans)、厚壁菌门(Firmicutes bacterium)以及一些未知菌属关系的非培养样品序列.其中条带6、12、13、14较强，变化稳定，为CSTR产酸相主要优势菌群.条带6为非培养的不动杆菌属，条带12为双酶梭状芽孢杆菌，条带13为非培养厚壁菌门，条带14为假单胞菌属.另外，通过BLAST序列比对发现，CSTR产酸相中没有发现与梭菌属具有较高相似性的条带，这与VFA测定中没有丙酸积累相对应.Katariina Tolvanen[10]等在研究牛粪与青草贮在CSTR共代谢厌氧发酵中同样发现杆菌属是反应器内主要优势种群.杆菌形成一个系统发育高度多样化的群体，作为厌氧反应中聚合物水解发酵降解菌.而且，杆菌也是动物肠道和粪便中常见菌群，是一种兼性厌氧菌.Hernon[11]指出在中温条件下，运用厌氧发酵反应器降解富含碳水化合物的废弃物时，发现杆菌是最主要的菌群.Shigematsu[12]在研究利用恒化器中降解长链脂肪酸的微生物多样性中发现杆菌是在降解长链脂肪酸中最主要的优势菌群.Clostridium bifermentans是一种在排泄物、污泥及土壤中广泛存在的物种.C·C·Wang[13]等在利用污泥作为污水厌氧发酵的接种物时分离到Clostridium bifermentans，并发现该菌株明显提高了反应的产氢量.厚壁菌门(Firmicutes)在厌氧反应中的广泛存在，反映了它们代谢如蛋白质、脂类、糖类、氨基酸、木质素、纤维素的能力[14].Leven[15]等研究表明厚壁菌门(Firmicutes)具有产生纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶和其他外连接酶的能力，这表明它们在水解和酸化过程中起了重要作用.Salinicoccussp.在厌氧发酵中显见报道，并且在本混合共代谢发酵反应器中，发现一些无法归类种属关系的非培养样品.通过以上分析推测，在混合发酵反应器内微生物多样性丰富，不仅存在富含降解碳水化合物的废弃物菌群、降解长链脂肪酸菌群以及代谢纤维素的菌群，而且存在一些无法归类种属关系的菌群，故推断本混合共代谢CSTR产酸反应器中存在特殊的厌氧发酵系统，微生物种类丰富.

图7 CSTR产酸相不同阶段DGGE图谱系统进化树

3 结 论

1)以水稻秸秆、牛粪、糖蜜废水三种底物共代谢发酵的CSTR产酸相中，在反应器初期30 d时，为反应器产酸高峰期，大量VFAs的产生使得pH值迅速下降.pH值缓慢上升，稳定在6.2～6.5之间.产酸相ORP值一直在-250～-400 mV之间浮动，满足产酸菌的生长条件.

2)混合共代谢发酵具有很强的碳源氮源互相补充的能力，在反应60 d时，仍能满足C/N比为27∶1，有利于发酵的进行.通过红外光谱观察，发现120 d内，水稻秸秆中纤维素得到有效降解，并且促使了碳酸盐的生成，为产甲烷相提供适宜的发酵底物.

3)混合共代谢CSTR产酸相中VFAs在反应120 d内各种类质量浓度变化比较明显，在前80 d，乙酸、丁酸、戊酸质量浓度均属于增加阶段.后期60 d，丙酸含量迅速下降，没有出现酸积累现象.反应器内主要以乙酸为主.

4)通过对CSTR产酸相不同阶段样品进行群落结构解析，发现产酸相中存在丰富的微生物群落，DGGE图谱中优势条带所指示的菌属有假单胞菌属(Pseudomonassp.)、不动杆菌属(Acinetobactersp.)、盐水球菌属(Salinicoccussp.)、双酶梭状芽孢杆菌(Clostridiumbifermentans)、厚壁菌门(Firmicutesbacterium)以及一些未知菌属关系的非培养样品序列.

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Researchondirectionalproductionacidfermentationbasedonmanysubstratesmixedmetabolic

LI Chun-ying, LI Xiao-yan

(School of Energy and Civil Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150028, China)

In this paper, three substrates mixed fermentation included cow dung, rice straw and molasses wastewater were used as acidogenic-phase, combined with IC methane-producing phase to conduct two-phase anaerobic fermentation. The aim is to increase the amount of acidification production. The rice straw degradation situation was observed through pH, ORP value, the VFAs, TOC, TN, the determination of soluble COD concentration and infrared spectrum (FTIR). The changes of dominant population of acidification were observed by PCR and DGGE, which can adjust the optimal metabolic fermentation substrates. The results showed that pH, ORP would decrease before 30 d at anaerobic fermentation of CSTR reactor. The pH value was about 6.2～6.5, and the ORP value was between -250 mv and 250 mv. After 30 d, the content of TOC, TN and soluble COD concentration were increased. After 60 d, C/N ratio still was 27∶1. The TOC, TN, and soluble COD content tend to be stable. The content of acetic acid, propionic acid, butyric acid, pentanoic acid was first increased then fell. After 60 d, propionic acid felled rapidly, with no acid accumulation phenomenon, and the reactor was given priority to acetic acid. The rice straw got effective degradation by FTIR. Clostridium bifermentans, Firmicutes bacterium, Pseudomonas aeruginosa are advantage bacterium group.

substrate; total of metabolism; mixed fermentation; PCR-DGGE

2016-12-10.

黑龙江省自然科学基金(B201415；QC2015010)

李春颖(1980 -)，女，博士，讲师，研究方向：给水及污水处理.

李晓燕(1962-)，女，博士，教授，研究方向：环境微生物以及制冷工程研究.

X703

A

1672-0946(2017)05-0581-07