糖痹康对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经PERK-Nrf2信号通路的影响*

穆晓红，高 健，刘铜华，秦灵灵，孙 文，吴丽丽，李伟笠，邓博文，李筱叶

(1.北京中医药大学东直门医院，北京100700;2.对外经济贸易大学，北京100023;3.北京中医药大学，北京100029)

糖痹康对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经PERK-Nrf2信号通路的影响*

穆晓红1，高 健2，刘铜华3，秦灵灵3，孙 文3，吴丽丽3，李伟笠3，邓博文3，李筱叶3

(1.北京中医药大学东直门医院，北京100700;2.对外经济贸易大学，北京100023;3.北京中医药大学，北京100029)

目的:观察糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经中PERKNrf2信号通路的影响。方法:将雄性SD大鼠采用STZ法造模，成功后随机分为模型对照组，弥可保组，糖痹康高、中、低剂量组，另选正常SD大鼠为正常对照组。弥可保组腹腔注射弥可保0.026 8g/(kg·d);糖痹康高、中、低剂量组依次灌胃糖痹康16.700，8.350，4.175 g/(kg·d)。所有药物均以9 g/L生理盐水配制，给药量为0.01 mL/g体质量。模型对照组和正常对照组均予等量的生理盐水灌胃，1 d 1次，连续16周。剖取大鼠坐骨神经，Western blot检测坐骨神经中磷酸化的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2);Real-time PCR检测坐骨神经中血红素加氧酶-1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)mRNA 表达。结果:与正常对照组对比，模型对照组大鼠坐骨神经PERK、Nrf2蛋白表达显著降低，HO-1、γ-GCS mRNA表达显著降低，差别有统计学意义(P＜0.05)。与模型对照组对比，弥可保组和糖痹康高、中、低剂量组大鼠坐骨神经PERK、Nrf2蛋白表达显著升高，HO-1、γ-GCS mRNA表达显著升高，差别有统计学意义(P＜0.05)。结论:糖痹康通过上调PERK-Nrf2信号通路表达，发挥抗氧化作用，延缓糖尿病周围神经病变进展。

糖痹康/药效学;糖尿病周围神经病变;磷酸化的蛋白激酶样内质网激酶(p-PERK);转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2);血红素加氧酶-1(HO-1);γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS);动物;大鼠

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病患者常见并发症，常导致感觉神经、运动神经损伤，出现肢体麻木、疼痛、肌肉无力及萎缩等症状。研究发现，神经病变与氧化应激关系密切［1-3］，其中磷酸化的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)—转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)信号通路对高糖环境下活性氧的产生有抑制作用，能够改善抗氧化应激损伤［4］，在DPN的防治中发挥重要作用。血红素加氧酶-1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是PERK-Nrf2信号通路调节的抗氧化蛋白，同样参与抗氧化应激作用［5］。糖痹康由黄芪、女贞子、桂枝、赤芍、黄芩、黄连、水蛭等组成，是在《金匮要略》黄芪桂枝五物汤基础上根据临床经验加减化裁而成，已获发明专利(专利申请号:200810167551.1)。前期研究［6-8］发现:糖痹康能够改善DPN大鼠神经传导速度、调节大鼠血清及坐骨神经中神经生长因子(nerve growth factor，NGF)含量和表达、抑制神经细胞凋亡等发挥抗氧化应激的作用。本研究建立DPN大鼠模型并以糖痹康进行干预，研究PERK-Nrf2及其下游基因 HO-1、γ-GCS的表达，以探讨糖痹康对DPN的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级雄性健康SD大鼠80只，6～7周龄，体质量180～230 g，购自北京维通利华动物实验中心，动物许可证号:SCXK(京)2006-0009。大鼠饲养于北京中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室，温度(23±2)℃、湿度(55±10)%，12/12 h光照、黑暗循环，自由摄食、饮水。

1.2 药品、试剂与仪器

糖痹康颗粒处方组成:黄芪、女贞子、桂枝、赤芍、黄芩、黄连、水蛭等，颗粒剂由北京中医药大学中药学院提取、制备;弥可保(a-硫辛酸)，购自卫材药业有限公司，批号141003;链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司产品，批号S0130;高脂饲料(基础饲料65.75%、蔗糖20%、猪油10%、蛋黄粉3%、胆固醇1%、猪胆盐0.25%)，北京科奥协力饲料有限公司产品;Trizol试剂盒，购自Life Technologies公司，批号98903;I抗 Nrf2 Rabbit mAb(货号 12721)、Phospho-PERK Rabbit mAb(货号3179)、Ⅱ抗Anti-rabbit IgG(H+L)(货号14708)，均为 CST公司产品;THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，日本 TOYOBO 公司产品，货号QPS-201;ECL发光液，购自美国BIORAD公司，批号170-5060。E9032型酶标仪，美国Promega公司产品;Prism 7 500型PCR扩增仪，美国ABI公司产品;BX53型光学显微镜，日本Olympus公司产品;Mini-PROTEAN Tera System型垂直电泳仪、转移槽，美国Bio-Rad公司产品;ChemiDocTM XRS+with Image LabTM Software凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司产品。

1.3 模型的建立、分组与给药

将雄性SD大鼠适应性喂养1周，按体质量随机取10只作为正常对照组，以普通饲料喂养;其余大鼠以高脂饲料喂养8周后，禁食不禁水过夜，次日腹腔注射STZ 45 μg/g造模，72 h后用血糖仪测尾尖血血糖，血糖水平持续≥16.7 mmol/L且稳定3 d者为造模成功［7］。将造模成功的大鼠按体质量、血糖随机分为模型对照组，弥可保组，糖痹康高、中、低剂量组5组，每组10只。各组大鼠按体表面积法换算给药剂量:弥可保组腹腔注射弥可保0.026 8 g/(kg·d);糖痹康高、中、低剂量组依次灌胃糖痹康16.700 0，8.350 0，4.175 0 g/(kg·d)。所有药物均以 9 g/L生理盐水配制，给药量为0.01 mL/g体质量，模型对照组和正常对照组均予等量的生理盐水灌胃，1 d 1次，连续16周。

1.4 检测指标

连续给药16周后，禁食不禁水12 h，根据大鼠体质量，按350 μg/g的剂量腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，处死大鼠，迅速剖取大鼠两侧坐骨神经并以液氮冻存，待用。

1.4.1 大鼠坐骨神经中PERK、Nrf2蛋白表达

以Western blot测定。取冻存的大鼠坐骨神经，按RIPA试剂盒步骤提取总蛋白，加上样缓冲液，100℃ 5 min 蛋白变性;上样 20 μg/孔，10%SDSPAGE凝胶跑电泳，100V 2 h;半干法凝胶转膜100 A 1 h;TBS溶液室温洗膜15 min;Blocking one/Blocking one-P封闭30 min，I抗(1∶1 000稀释)孵育，4℃ 过夜;洗膜后II抗(1∶10 000稀释)孵育，室温1 h;洗膜后，ECL发光液室温反应1 min，凝胶成像系统成像，以Image J 7.0分析蛋白条带。

1.4.2 坐骨神经中 HO-1、γGCS mRNA 表达

以Real-time PCR测定。取冻存的大鼠坐骨神经，Trizol提取总RNA;GoScriptTMReverse Transcription System试剂盒反转录，退火25℃ 5min，延伸42℃ 1 h，灭活 70℃ 15 min，得到 cDNA。配制20 μL反应体系:2 μL cDNA 稀释液 +10 μL GoTaq反应液 +7.2 μL Nuclease-Free Water+0.8μL 引物混合，Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System扩增，条件:95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃1 min(共40次循环);95℃ 15s，60℃ 15 s溶解。结果采用2-△△CT相对定量法比较各组目标mRNA表达差异。引物见表1。

表1 引物

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠坐骨神经PERK、Nrf2蛋白表达对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠坐骨神经PERK、Nrf2蛋白表达显著降低，差别有统计学意义(P＜0.05)。与模型对照组对比，各给药组PERK、Nrf2蛋白表达显著升高，差别有统计学意义(P＜0.05)。见表2、图1。

表2 各组大鼠坐骨神经PERK、Nrf2蛋白表达对比n=10±s

表2 各组大鼠坐骨神经PERK、Nrf2蛋白表达对比n=10±s

注:与正常对照组对比，*P＜0.05;与模型对照组对比，#P＜0.05

分组 剂量/(g·kg－1·d －1)PERK/β-actin Nrf2/β-actin正常对照组 —0.86 ±0.13 0.80 ±0.04模型对照组 — 0.37±0.06* 0.28±0.11*弥可保组 0.026 8 0.82 ±0.17# 0.78 ±0.07#糖痹康高剂量组 16.700 0 0.94 ±0.10# 0.98 ±0.14#糖痹康中剂量组 8.350 0 0.76 ±0.07# 0.85 ±0.15#糖痹康低剂量组 4.175 0 0.70 ±0.12# 0.80 ±0.10#

图1 各组大鼠坐骨神经PERK、Nrf2蛋白条带

2.2 各组大鼠坐骨神经HO-1、γGCS mRNA表达对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠坐骨神经HO-1、γGCS mRNA表达显著降低，差别有统计学意义(P＜0.05)。与模型对照组对比，各给药组HO-1、γGCS mRNA表达显著升高，差别有统计学意义(P ＜0.05)。结果见表3。

表3 各组大鼠坐骨神经HO-1、γGCS mRNA表达对比n=10，±s

表3 各组大鼠坐骨神经HO-1、γGCS mRNA表达对比n=10，±s

注:与正常对照组对比，*P＜0.05;与模型对照组对比，#P＜0.05

分组 剂量/(g·kg－1·d －1) HO-1 γGCS正常对照组 —0.96 ±0.06 0.98 ±0.02模型对照组 — 0.66±0.11* 0.72±0.15*弥可保组 0.026 8 1.01 ±0.10# 1.13 ±0.10#糖痹康高剂量组 16.700 0 1.45 ±0.17# 1.25 ±0.10#糖痹康中剂量组 8.350 0 1.17 ±0.13# 1.12 ±0.06#糖痹康低剂量组 4.175 0 1.13 ±0.08# 1.04 ±0.12#

3 讨论

氧化应激是机体氧自由基生成和(或)消除能力之间的不平衡，出现活性氧簇(ROS)增加与抗氧化清除减弱，最终导致损伤组织细胞、蛋白的过程［9］。研究表明，高糖状态下机体多条旁路代谢途径激活，引起细胞内产生过多ROS，诱导氧化应激发生［10］。因此，氧化应激在在糖尿病发展中至关重要。据糖尿病并发症的统一机制学说，DPN发病核心是高糖引起线粒体中ROS生成过多，引发组织细胞发生氧化应激，导致DNA损伤，引起周围血管、神经病变，出现血流变异常，神经传导速度减低以及病理改变等，最终导致 DPN［11］。

PERK作为内质网上跨膜蛋白之一，正常情况下发生磷酸化而被激活，激活后的PERK能够激活Nrf2，活化后的Nrf2进入细胞核内与小Maf蛋白结合调控基因转录，包括 HO-1、γGCS［12－13］。PERKNrf2是重要的抗氧化应激通路，在延缓糖尿病及其并发症的发展中发挥重要作用。研究表明，DPN患者存在氧化应激导致体内ROS产生过多，各种抗氧化物质如 HO-1、γGCS 等降低，抗氧化能力下降［14］。PERK-Nrf2信号通路激活可降低DPN患者ROS的产生，同时调控抗氧化基因HO-1、γGCS的转录，而HO-1、γGCS能够启动机体抗氧化系统，清除自由基起到保护细胞的作用［15－16］。本研究结果显示:模型对照组大鼠坐骨神经内PERK、Nrf2蛋白表达与HO-1、γGCS mRNA表达均较正常大鼠显著降低，而经过糖痹康治疗后，此4个指标表达均显著升高，表明糖痹康对PERK-Nrf2信号通路及其下游分子HO-1、γGCS的表达具有调控作用。

中医学认为DPN属于“痹症”“痿证”等范畴，是气阴两虚基础上导致久病入络、脉络瘀阻、气血运行阻滞的过程，治疗上应以益气养阴、化瘀通络为法［17］。糖痹康方中黄芪、女贞子益气养阴，黄芩、黄连清热解毒，赤芍、水蛭活血化瘀通络，桂枝通脉。全方共奏益气养阴清热、化瘀通络之效。本实验结果提示:糖痹康通过调控调PERK-Nrf2信号通路及其下游分子HO-1、γGCS的表达而抵抗活跃氧化应激，从而改善神经细胞功能来状态，进而起到了神经保护作用。

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R573.1

B

10.3969/j.issn.1001 －6910.2017.11.32

1001－6910(2017)11－0070－04

刘铜华，北京中医药大学，教授，thliu@vip.163.com

国家自然基金项目(81202970);教育部新世纪人才项目(NCET－12－0805)

2017－10－19;

2017－11－16(编辑 陶 珠)