痛泻要方及防风对肝郁脾虚型溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜COX-2及外周血中IL-6的影响*

郭军雄，闫立国

(河西学院医学院，甘肃张掖734000)

痛泻要方及防风对肝郁脾虚型溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜COX-2及外周血中IL-6的影响*

郭军雄，闫立国

(河西学院医学院，甘肃张掖734000)

目的:观察痛泻要方及防风对溃疡性结肠炎大鼠结肠 黏膜COX-2，血清白细胞介素－6(IL-6)的影响。方法:将72只Wistar大鼠分为6组，应用病证结合复合法复制肝郁脾虚型溃疡性结肠炎大鼠后，分别给予防风、痛泻要方去防风、痛泻要方、柳氮磺胺吡啶灌胃治疗，正常对照组和模型对照组给予生理盐水。4周后处死大鼠，分离血清和结肠组织，评价结肠组织损伤，采用免疫组化法检测结肠组织COX-2水平，放射免疫法检测血清IL-6的水平。结果:痛泻要方组结肠黏膜的损伤、COX-2蛋白表达，血清IL-6水平较防风组、痛泻要方去防风组有明显下降，痛泻要方组与模型对照组对比，差别有统计学意义(P＜0.01)。结论:痛泻要方可下调溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜COX-2蛋白的表达，降低血清IL-6炎性因子的水平来促进溃疡的愈合，而防风在全方中发挥了不可替代的佐助作用。

痛泻要方/药效学;防风/药效学;溃疡性结肠炎;COX-2;IL-6;动物;大鼠

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)作为非特异性肠道炎症性疾病，病因和发病机制尚不明确，临床以腹痛、腹泻和黏液脓血便为主要表现。大部分UC可伴终身，严重影响患者的生活质量，并有一定的结肠癌变倾向，迄今尚无特效的治疗方法，已被世界卫生组织列为现代难治病之一。研究［1－2］指出，环氧合酶－2(COX-2)和白细胞介素－(IL-6)与 UC的病情进展息息相关，可作为检测 UC发展程度的重要指标。中医药治疗UC具有明显优势，临床组方中常配伍风药治疗UC，效果良好，但其治疗机制不明。前期研究［3］表明:痛泻要方配伍风药(柴胡、升麻)可通过清除氧自由基、抗氧化来减轻UC大鼠结肠组织的损伤。本课题组拟在前期研究基础上，采用2，4，6－三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠法建立UC大鼠，观察防风、痛泻要方、痛泻要方去防风对UC大鼠结肠黏膜COX-2、血清IL-6的影响，探索痛泻要方及防风治疗UC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级 wistar大鼠，雌雄各 36只，体质量(180±20)g，购于甘肃中医药大学科研实验中心，动物合格证号:SCXK(甘)2011-0001。饲养于甘肃中医药大学科研实验中心SPF级实验室，设施合格证号:SYXK(甘)2011-0001。

1.2 药品、试剂与仪器

炒白术、炒白芍、炒陈皮、防风饮片均由河西学院第二附属医院药房提供。依据《景岳全书·卷之五十四书集》［4］中痛泻要方的药物剂量的比例确定上述中药的用量。将中药洗净，浸泡40 min，加水煎煮两次，合并煎液，过滤，95℃水浴浓缩至每毫升含生药0.75 g。痛泻要方祛除防风或单纯选择防风，按上述方法制备水煎剂，使每毫升含生药0.75 g。将以上药物分装，高压灭菌消毒，冰箱保存备用。柳氮磺胺吡啶肠溶片(SASP)，0.25 g/片，上海信谊天平药业有限公司产品，批号09140806，用研钵研碎，溶于蒸馏水中，调配成0.03 g/mL的混悬液备用。2，4，6 －三硝基苯磺酸(TNBS)，Sigma公司产品，批号2008-16-2;无水乙醇，天津市化学试剂工厂提供，批号20140501;白介素－6(IL-6)放射免疫药盒，购自北京华英生物技术研究所，批号20151015;大鼠抗COX-2免疫组化试剂盒，购自北京博奥森生物技术有限公司，批号AE062452;SP-9001生物素标记山羊抗兔IgG免疫组化检测试剂盒(批号15121A01)和浓缩型DNA试剂盒(批号K146712F)，购自北京中杉金桥公司。γ－911全自动放免计数仪，中国科技大学实业总公司产品;TGL－16G离心机，上海安亭科学仪器厂产品;BI－2000型医学图像分析系统，成都泰盟科技有限公司产品;MiE图像处理系统，山东易创电子有限公司产品;OLYMPUS－CX21型显微镜，产地日本。

1.3 动物分组与模型的建立

将动物随机分为正常对照组、模型对照组、柳氮磺胺吡啶组、防风组、痛泻要方组、痛泻要方去防风组，每组12只。除正常对照组外，其余各组采用TNBS/乙醇溶液灌肠外加束缚法和饮食失节复合法制备肝郁脾虚型UC大鼠模型［5］:造模各组大鼠每日不定时束缚四肢，限制其自由活动4 h左右;隔日喂养，模拟饮食饥饱失常。束缚1周后，所有动物禁食(不禁水)24 h;用质量分数为100 g/L的水合氯醛(3 μL/g)腹腔麻醉;取直径 2 mm、长12 cm聚丙烯管，由肛门轻缓插入约8 cm深的肠腔内，将TNBS/乙醇液(100 μg/g TNBS+500 mL/L 的乙醇0.25 mL)缓慢推入结肠;捏紧肛门，提取大鼠尾巴倒立1 min，使注入药液与结肠充分接触;麻醉清醒后正常喂养;第2天即为造模成功。正常对照组大鼠于肛门内约8 cm处注入等体积生理盐水。

1.4 给药方法

各组于造模成功后第2天开始灌胃，药物等效剂量以成人常规剂量的10倍计算，各中药组均按相当于生药7.5 g/kg剂量灌服，SASP组按0.3 g/kg剂量灌服，正常对照组与模型对照组每日予以等体积生理盐水灌服，1 d 1次，连续21 d。

1.5 检测指标

1.5.1 血清 IL-6含量

灌胃结束，各组大鼠禁食、不禁水24 h，乙醚麻醉后股动脉采血5 mL，37℃水中放置30 min，3 000 r/min离心10 min，分离血清，于4℃ 冰箱保存，测血清IL-6含量。检测由北京华英生物技术研究所承担，严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.2 结肠黏膜损伤及 COX-2蛋白表达

采血后脱颈处死大鼠，迅速剖取距肛门2～10 cm处结肠，沿肠系膜缘剪开肠腔并展平，用生理盐水冲洗，肉眼观察，比较各组大鼠结肠黏膜损伤;取部分结肠组织，以40 g/L多聚甲醛固定，采用免疫组化SP法检测结肠黏膜COX-2，操作严格按试剂盒说明书进行。

结肠黏膜损伤评分按照Luketal［6］标准。0分:无炎症和溃疡。1分:充血但无溃疡。2分:充血、肠壁变厚但无溃疡。3分:有1处溃疡及炎症，直径0～1 cm。4分:溃疡较大，直径1～2 cm，肠管与外周脏器组织无粘连。5分:溃疡延伸直径超过2 cm，肠管增厚，并与周围脏器组织粘连严重。

COX-2蛋白表达以胞浆或核膜内有棕黄色颗粒为阳性，阳性染色细胞≤10%为阴性(－)，＞10%且≤30%为弱阳性(+)，＞30%且≤50%为阳性(++)，＞50%为强阳性(+++)。采用BI－2000型医学图像免疫组化分析系统，随机选择5个视野，测量阳性细胞平均积分吸光度，吸光度越大蛋白表达越强，反之则表达越弱。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠血清IL-6含量对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠血清IL-6含量升高，说明造模后大鼠IL-6含量明显升高(P＜0.01)。与模型对照组对比，痛泻要方组和SASP组IL-6含量均降低(P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-6含量对比x±s

2.2 结肠黏膜损伤及评分对比

肉眼观察:正常对照组大鼠肠管无增厚及粘连，肠黏膜光滑平整，皱襞纹理清楚，无充血、糜烂及溃疡。模型对照组大鼠肠管增厚，肠黏膜明显充血、水肿、可见散在多处糜烂和溃疡面，部分肠管粘连，组织损伤评分较正常对照组明显增高，差别有统计学意义(P＜0.01)。防风组大鼠肠黏膜轻度充血、水肿，可见部分溃疡和糜烂面。痛泻要方去防风组大鼠肠管不厚，有轻度的充血、水肿，未见明显糜烂和溃疡面，可见溃疡愈合瘢痕。痛泻要方组和柳氮磺胺吡啶组大鼠肠黏膜偶有轻度的充血、水肿。与模型对照组对比，防风组、痛泻要方去防风组、痛泻要方组、柳氮磺胺吡啶组结肠黏膜损伤评分降低，尤以痛泻要方组、柳氮磺胺吡啶组最为明显 (P＜0.01)。见表 2。

2.3 各组大鼠结肠黏膜COX-2蛋白表达阳性细胞平均积分光密度对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠结肠黏膜COX-2蛋白表达阳性细胞平均积分光密度上升，差别有统计学意义(P＜0.01);与模型对照组对比，痛泻要方与柳氮磺胺吡啶组结肠黏膜COX-2蛋白表达阳性细胞平均积分光密度降低，差别有统计学意义(P ＜0.01)。见表3。

表2 各组UC大鼠结肠黏膜损伤评分的比较x±s

表3 各组大鼠结肠黏膜COX-2蛋白表达阳性细胞平均积分光密度对比x±s

2.4 各组大鼠结肠组织COX-2蛋白的表达

正常对照组大鼠结肠黏膜COX-2蛋白呈阴性，模型对照组COX-2呈强阳性，防风组COX-2呈阳性，痛泻要方去防风组COX-2呈阳性，痛泻要方组COX-2呈弱阳性，柳氮磺胺吡啶组COX-2呈弱阳性。见图1。

图1 免疫组化图片(SP染色，×40倍)

3 讨论

溃疡性结肠炎又被称为非特异性溃疡性结肠炎，与克隆病合称为炎症性肠病。UC病变主要位于结肠黏膜和黏膜下层，且以溃疡为主，常累及直肠和结肠远端，也可累及整个结肠。探寻UC病因和发掘治疗药物一直是医学界研究的热点。目前研究多认为，UC与机体免疫反应的交互性、环境、遗传易感性等紧密相关，尤与肠黏膜局部免疫反应的异常关系密切。COX-2是体内花生四烯酸转化为前列腺素代谢过程中的关键酶，正常结肠黏膜细胞不表达或表达甚少，一旦受到炎性介质、细胞因子、内毒素等刺激，COX-2表达量迅速增加，从而合成多种过量的PGE2等前列腺素类物质，最终导致结肠黏膜充血、水肿、炎细胞浸润等炎症反应，并影响肠管运动和血流量，使本已存在的炎症放大或持久化。越来越多的证据提示，COX-2表达与UC炎症发展密切相关［7－8］。IL-6是一个具有多种潜能的前炎症细胞因子，可由活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞等分泌。IL-6的表达过量会引发机体内环境紊乱，促使肠上皮细胞的电解质分泌增加，通透性增强，中性粒细胞浸润;同时，IL-6还可结合可溶性IL-6受体形成IL-6/sIL-6R/gp130复合物，活化相应受体，介导UC炎症的级联反应，导致UC炎性病变的持续与加重［9－10］。

根据UC的发病规律及证候特征，可将其归属于中医学“肠澼”“休息痢”等范畴。有文献［11］统计，全国UC患者以大肠湿热、脾胃虚弱、肝郁脾虚和脾肾两虚证为主。肝郁脾虚型UC患者常因饮食失宜或情志因素诱发腹痛、腹泻、多见黏液血便，伴情绪抑郁、焦虑，嗳气不爽，腹胀食少，这与痛泻要方主治的脾虚肝郁证不谋而合。方中重用白术苦甘而温，补脾运湿以治土虚;白芍酸寒，柔肝缓急止痛;陈皮辛苦而温，理气醒脾和胃;尤妙配少量风药防风，专入肝脾二脏，辛能散肝郁，香能舒脾气，且为脾经引经药，其性轻灵升浮，能胜湿而止泻。临床治疗UC，配伍防风和去掉防风疗效大不相同。本研究通过对实验性UC大鼠灌服防风、痛泻要方去防风、痛泻要方，发现痛泻要方全方在促进结肠黏膜损伤的愈合方面明显优于单纯的防风和痛泻要方去防风方，初步提示:痛泻要方或方药配以风药防风可通过下调结肠COX-2蛋白的表达、外周血清IL-6炎性因子的水平来减轻肠黏膜的炎性反应和促进溃疡的愈合。本研究亦为临床适当配伍风药能显著提高UC的治疗效果提供了实验依据。

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1001－6910(2017)11－0073－05

R573.1

B

10.3969/j.issn.1001 －6910.2017.11.33

郭军雄(1977－)，男(汉族)，甘肃通渭人，副教授，医学硕士，主要从事中医药防治溃疡性结肠炎的基础及临床研究。

甘肃省教育厅基金资助项目(1030－02);河西学院科研创新与应用校长基金项目(XZ2014－32)

2017－06－06;

2017－10－23(编辑 陶 珠)